Сборник основных правил, технологических инструкций и нормативных материалов по производству винодельческой продукции
Последние фракции смывных вод сдать на проверку микробиологу завода.
II. ШАМПАНСКОЕ И ИГРИСТЫЕ ВИНА
ОСНОВНЫЕ ПРАВИЛА ПРОИЗВОДСТВА
РОССИЙСКОГО ШАМПАНСКОГО И ИГРИСТЫХ ВИН
1. Общие положения
1.1. Российское шампанское и игристые вина - категория вин, пересыщенных диоксидом (двуокисью) углерода в результате брожения подсахаренных виноматериалов, недобродов или сусла в герметических сосудах под избыточным давлением.
1.2. Формирование, развитие и сохранение характерных для различных групп шампанских и игристых вин органолептических и других показателей качества возможно только при соблюдении в процессе их производства, выдержки и реализации специальных требований, выработанных на базе теоретических исследований и анализа богатого практического опыта приготовления вин этой категории во многих странах различными методами. Эти требования обобщены в настоящих "Основных правилах производства Российского шампанского и игристых вин" (далее по тексту - "Основные правила").
1.3. Вино определенного наименования данной категории изготавливают по технологической инструкции на вино этого наименования (или группу вин). В технологической инструкции конкретизируют требования действующих санитарных норм и других нормативно-технических документов применительно к определенному производству, детализируют технику осуществления и устанавливают оптимальные режимы проведения технологических процессов.
Перед освоением производства новых вин технологическую инструкцию разрабатывают, утверждают и регистрируют в установленном порядке.
1.4. Правом производства Российского шампанского и игристых вин пользуются любые предприятия независимо от их формы собственности, зарегистрированные на этот вид деятельности в соответствии с установленным порядком.
2. Классификация
2.1. По органолептическим свойствам, особенностям технологии и давлению диоксида углерода в бутылках с готовой продукцией различают следующие основные группы вин: Российское шампанское и игристые вина. В группе игристых вин выделяют подгруппу жемчужных.
Российское шампанское. Разрешается производство шампанского под названием "Советское шампанское". Все вина этой группы готовят по действующей Технологической инструкции по производству Российского шампанского исключительно из удовлетворяющих установленным требованиям шампанских виноматериалов в соответствии с ГОСТ на виноматериалы шампанские.
Давление диоксида углерода в бутылках с Российским шампанским не менее 350 кПа при 20 °С.
Игристые. Группа вин, каждая марка которых обладает свойственными только ей оригинальными органолептическими показателями, связанными с используемыми сортами винограда и особенностями технологии. Готовят из виноматериалов, выработанных из технических, районированных в местах произрастания сортов винограда.
Натуральные игристые вина представляют собой естественные недоброды, полученные брожением виноградного сусла или восстановленного концентрированного очищенного сусла.
Давление диоксида углерода в бутылках с вином должно быть не менее 350 кПа при 20 °С.
Жемчужные. Подгруппа вин, аналогичных игристым, но с меньшим давлением диоксида углерода (не менее 350 кПа при 20 °С).
2.2. По цвету в группе игристых и подгруппе жемчужных различают вина белые, розовые и красные. Общая характеристика каждого цвета приведена в п. 3.2.
2.3. По содержанию сахара (в г/куб. дм) во всех группах различают: "брют" (не более 15,0), "сухое" (20,0 - 25,0), "полусухое" (35,0 - 45,0), "полусладкое" (55,0 - 65,0), "сладкое" (75,0 - 85,0). Если в наименовании игристых вин данные термины не используются, то они могут иметь и иное содержание сахара, предусмотренное технологической инструкцией, но не более 100 г/куб. дм.
2.4. По продолжительности выдержки вина различают:
без выдержки;
"выдержанное" - со сроком выдержки после окончания процесса шампанизации не менее 6 мес.;
"коллекционное" - реализуемое с обозначенным годом шампанизации вина после не менее 3-летней выдержки в бутылках.
2.5. По методу производства различают вина, приготовленные шампанизацией:
в бутылках;
в резервуарах периодическим методом;
в резервуарах непрерывным методом.
2.6. Каждая марка вина имеет собственное наименование, установленное разработчиком технологии или изготовителем и согласованное при регистрации технологической инструкции. Название вина не должно вводить покупателя в заблуждение относительно его происхождения, состава, сорта винограда, из которого оно изготовлено, и любых его характеристик. Не допускается выработка разных вин под одним наименованием.
3. Технические требования
3.1. Для вин всех групп приняты следующие общие требования по прозрачности, характеристике пенистых и игристых свойств:
прозрачность - прозрачное без осадка и посторонних включений. Единичные мелкие (размером до 1 мм) кусочки пробки к посторонним включениям не относятся;
пенистые и игристые свойства - после вскрытия бутылки и налива в бокал происходит вспенивание вина на поверхности и наблюдается непрерывно продолжающаяся "игра", связанная с выделением из массы вина и подъемом пузырьков газа.
3.2. Остальные огранолептические показатели (цвет, букет и вкус) индивидуальны для каждой марки вина. С учетом используемых сортов винограда, принятого метода производства и условий технологии их устанавливают практически и фиксируют в технологических инструкциях, пользуясь при описании следующими основными принципами:
Цвет - для вин группы Российское шампанское и белых игристых вин - светло-соломенный, с оттенком от зеленоватого до золотистого, а в игристых - до светло-янтарного;
розовых - преимущественно розовый различной интенсивности с характерными оттенками, близкими к розовому цвету (малиновым, брусничным и др.);
красных - от светло- до темно-красного с конкретными оттенками (вишневым, гранатовым, рубиновым и др.).
Букет - развитый, гармоничный, полностью соответствующий группе вина, его возрасту и методу производства, с уточнением оттенков, характерных для вин конкретных наименований.
Вкус - полный, гармонирующий с букетом, без посторонних привкусов, отличающийся специфическими оттенками, соответствующими сорту винограда, группе вина, возрасту и методу производства.
Для всех вин должно быть характерным полное соответствие характеристики цвета, букета и вкуса конкретной марке вина. Обязательным требованием является отсутствие каких-либо посторонних, несвойственных вину оттенков.
3.3. Белые игристые вина должны иметь существенные отличия от вин группы Российское шампанское по характеристике букета и вкуса и/или иметь иную, чем указанная в п. 2.3, массовую концентрацию сахаров.
3.4. По химическим и физико-химическим показателям вина удовлетворяют требованиям, изложенным в таблице.
┌──────────────────────────────────────────┬──────────┬─────────┬─────────┐ │ Показатель │ Русское │Игристые │Жемчужные│ │ │шампанское│ вина │ вина │ ├──────────────────────────────────────────┼──────────┼─────────┼─────────┤ │Объемная доля этилового спирта, % об., не │10,5 │10,0 │8,5 │ │менее │ │ │ │ │Массовая концентрация сахаров, г/куб. дм │0 - 85,0 │0 - 100,0│0 - 100,0│ │Массовая концентрация титруемых кислот │5,5 - 8,0 │5,0 - 8,0│5,0 - 8,0│ │(в пересчете на винную кислоту), г/куб. дм│ │ │ │ │Массовая концентрация общей сернистой │200 │200 │200 │ │кислоты, мг/куб. дм, не более │ │ │ │ │Массовая концентрация приведенного │ │ │ │ │экстракта, г/куб. дм, не менее │ │ │ │ │ белое и розовое │16,0 │16,0 │16,0 │ │ красное │- │18,0 │18,0 │ │Массовая концентрация железа, мг/куб. дм, │ │ │ │ │не более │ │ │ │ │ белое │10 │10 │10 │ │ розовое и красное │- │15 │15 │ │Давление СО в бутылке с вином при 20 °С, │350 │350 │200 │ │ 2 │ │ │ │ │кПа, не менее │ │ │ │ └──────────────────────────────────────────┴──────────┴─────────┴─────────┘
Для конкретного наименования вина в указанных диапазонах устанавливают более узкие пределы показателей:
по объемной доле этилового спирта, %, не более 2;
по массовой концентрации сахаров, г/куб. дм, не более 10,
в т.ч. для натуральных - не более 20;
по массовой концентрации титруемых кислот, г/куб. дм, не более 2.
Предельные показатели массовой концентрации общей сернистой кислоты и железа могут быть для конкретных марок вина установлены на более низком уровне, а массовая концентрация приведенного экстракта и давление диоксида углерода в бутылке - на более высоком, чем указано в таблице.
Содержание токсичных элементов изготовитель гарантирует не выше уровня, установленного Гигиеническими требованиями к качеству и безопасности сырья и пищевых продуктов (СанПиН 2.3.2.560-96).
Покупатель вправе предъявлять дополнительные требования к составу вин, поставляемых на экспорт.
4. Сырье и материалы
4.1. Основное сырье и вспомогательные материалы для производства вин используют в соответствии с действующими ГОСТами.
5. Технологические приемы
5.1. При производстве Российского шампанского и игристых вин используют следующие технологические приемы:
- транспортирование виноматериалов железнодорожным, водным и автомобильным транспортом;
- ассемблирование и купажирование виноматериалов;
- осветление виноматериалов и вин механическим способом или с использованием специальных осветляющих веществ;
- деметаллизация виноматериалов при помощи желтой кровяной соли;
- нагревание виноматериалов и вин до температуры не выше точки кипения, в том числе нагревание готовых вин в бутылках (пастеризация);
- выдержка виноматериалов и купажей в условиях, предотвращающих их окисление;
- дезаэрация виноматериалов;
- охлаждение виноматериалов и шампанизированных вин до температуры не ниже -5 °С и обработка холодом;
- замораживание шампанизированного вина и бутылках до образования кристаллов льда;
- подслащивание сахарозой (в виде ликера) виноматериалов перед вторичным брожением и вин после шампанизации, подслащивание суслом, недобродами и сладкими винами при производстве игристых вин;
- приготовление ликеров;
- проведение брожения в герметичных сосудах под давлением диоксида углерода эндогенного происхождения с использованием дрожжей чистой культуры, в том числе адсорбированных на специальных носителях;
- создание противодавления диоксида углерода в резервуарах и бутылках перед наполнением шампанизированным вином;
- передавливание находящегося под давлением диоксида углерода шампанизированного вина из резервуара в другой резервуар или на розлив, передавливание шампанизированного вина из бутылки в бутылку или резервуар;
- подспиртовывание экспедиционного ликера коньячным спиртом или винным дистиллятом;
- сведение осадка на пробку (ремюаж) и удаление его (дегоржаж) при производстве вин бутылочным способом;
- выдержка шампанизированного вина в бутылках или крупных резервуарах;
- осветление шампанского вина фильтрацией при противодавлении;
- розлив шампанизированного вина при пониженной температуре в бутылки под избыточным давлением с укупоркой бутылок.
5.2. Технологические емкости, продуктопроводы и соприкасающиеся с вином части оборудования изготавливают из нержавеющей стали или наносят на их внутренние поверхности защитные покрытия, разрешенные для виноделия органами санэпиднадзора.
6. Условия хранения, транспортирования и реализации
6.1. В процессе производства и обработки виноматериалы и другие полуфабрикаты предохраняют от избыточного окисления кислородом воздуха.
6.2. Готовые вина для сохранения показателей качества должны храниться, транспортироваться и реализовываться при температуре от 5 до 20 °С.
6.3. Перед употреблением вина рекомендуется доводить до температуры: белые и розовые - 10 - 12 °С, красные - 16 - 18 °С.
7. Гарантии и ответственность
7.1. Предприятия-изготовители шампанских, игристых вин и полуфабрикатов для их производства обязаны обеспечить технохимический и микробиологический контроль на всех этапах технологии, начиная с момента приемки винограда до выпуска готовой продукции. Кроме того, должен быть обеспечен входной контроль за всеми основными и вспомогательными материалами, используемыми в производстве.
7.2. На каждую партию готовой продукции предприятие дает удостоверение о качестве, в котором гарантирует соответствие вина техническим требованиям и санитарной безопасности, а также гарантирует полное соблюдение в процессе производства требований основных правил и технологической инструкции.
Настоящие "Основные правила" обязательны для всех расположенных на территории Российской Федерации предприятий, производящих шампанское и игристые вина с целью реализации, независимо от подчиненности и форм собственности, в том числе совместных и принадлежащих другим государствам или их гражданам.
При зафиксированном нарушении настоящих правил выработанные вина не подлежат реализации. Они могут быть утилизированы на этиловый спирт или уксус. Допускается переработка забракованных шампанских и игристых вин на вина других категорий, если это не противоречит действующим нормативным документам на производство этих вин.
Предписания о запрете реализации выдаются уполномоченными органами. В случае нарушения запрета производитель или продавец несет ответственность в установленном законом порядке.
ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРОИЗВОДСТВУ ШАМПАНСКИХ ВИНОМАТЕРИАЛОВ
Настоящая технологическая инструкция распространяется на производство шампанских виноматериалов по ГОСТ Р 51147-98, предусматривающих производство шампанских, игристых и газированных вин на предприятиях Российской Федерации.
1. Характеристика готовой продукции
1.1. По органолептическим, химическим и физико-химическим показателям шампанские виноматериалы должны соответствовать ГОСТ Р 51147-98.
2. Характеристика сырья и материалов
2.1. Для производства шампанских виноматериалов применяют сырье и материалы в соответствии с ГОСТ Р 51147-98.
3. Описание технологического процесса
3.1. Контроль за ходом созревания винограда, назначение срока сбора, ручной сбор урожая винограда, транспортирование собранных гроздей и их переработку осуществляют согласно Общим правилам по переработке винограда на виноматериалы, утвержденным 09.08.1967, с использованием разделов, касающихся производства натуральных белых сухих марочных вин. Виноград машинной уборки на производство шампанских виноматериалов использовать запрещается.
3.2. Виноград каждого ампелографического сорта перерабатывают отдельно. Сусло предпочтительно извлекают прессованием целых гроздей винограда на корзиночных прессах.
3.3. Для производства шампанских виноматериалов отбирают самотечные и первые прессовые фракции сусла в количестве около 50 дал с 1 т винограда. Время отделения сусла не должно превышать 50 мин. при переработке дробленого винограда и 90 мин. при прессовании целых гроздей.
3.4. Шампанские фракции сусла собирают отдельно и подвергают осветлению центрифугированием или отстаиванием. При отстаивании его предварительно охлаждают до 10 - 12 °С, а после осветления декантируют. Разрешается сульфитация сусла до осветления введением в него двуокиси серы в количестве не более 50 мг/куб. дм. Осветленное сусло направляют в бродильные резервуары, куда добавляют около 1% разводки чистой культуры дрожжей специальных рас.
3.5. Оптимальная температура брожения 15 - 18 °С. По окончании бурного спиртового брожения создают условия, способствующие сбраживанию яблочной кислоты, повышая температуру до 21 - 22 °С. Брожение считают законченным при содержании сахаров не более 2 г/куб. дм и яблочной кислоты не более 0,5 г/куб. дм. Сброженные шампанские виноматериалы подвергают регулярной доливке или хранят в условиях, исключающих возможность развития болезнетворных микроорганизмов.
3.6. Для улучшения качества молодых виноматериалов, имеющих рН не выше 3,2, рекомендуется выдерживать их на осадках дрожжей 1,5 - 2,0 мес. при температуре не более 12 °С.
3.7. Виноматериалы после осветления или выдержки на дрожжах декантируют с осадка дрожжей и при необходимости одновременно эгализируют в партии в пределах сорта винограда.
3.8. Эгализированные шампанские виноматериалы, отвечающие требованиям ГОСТ Р 51147-98, могут быть использованы для производства шампанского на месте или отгружены на предприятия, выпускающие шампанское.
4. Хранение и транспортирование
4.1. Хранение и транспортирование шампанских виноматериалов осуществляют в соответствии с ГОСТ Р 51147-98.
4.2. Шампанские виноматериалы отгружают без какой-либо предварительной обработки и доведения до установленных кондиций. При необходимости допускается фильтрация.
До отгрузки виноматериалы хранят в условиях, гарантирующих сохранение качества и исключающих их окисление.
4.3. Виноматериалы транспортируют с соблюдением их температуры 5 - 20 °С. При заливе в транспортные цистерны оставляют воздушную камеру, достаточную для компенсации возможного увеличения объема виноматериала при перепаде температур в указанных пределах, но не более 2% от их полной вместимости.
4.4. На каждую отгружаемую партию шампанских виноматериалов поставщик выдает удостоверение о качестве, в котором указывает сорт винограда, химические показатели состава по ГОСТ Р 51147-98, органолептическую и микробиологическую характеристику н сертификат соответствия.
5. Требования к технологическому оборудованию
5.1. Для производства шампанских виноматериалов применяют типовое технологическое оборудование, отечественное или импортное, для предприятий по переработке технического винограда на виноматериалы.
6. Правила приемки
6.1. Правила приемки по ГОСТ Р 51144-98.
7. Краткое описание методов и средств контроля технологического процесса, качества сырья и готовой продукции
См. таблицу.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ МЕТОДОВ И СРЕДСТВ КОНТРОЛЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА, КАЧЕСТВА СЫРЬЯ И ГОТОВОЙ ПРОДУКЦИИ
┌────────┬─────────┬─────────┬──────────────────────┬───────────┬─────────────┐ │ Объект │ Место │Периодич-│ Контролируемый │Предельное │ Место и │ │контроля│контроля │ность │ параметр │ значение │ средство │ │ │ │контроля │ │ параметра │ контроля │ ├────────┼─────────┼─────────┼──────────────────────┼───────────┼─────────────┤ │Виноград│Транс- │Каждая │Массовая концентрация │17,0 - 20,0│ГОСТ 27198-87│ │шампанс-│портная │партия │сахаров, г/100 куб. см│ │ │ │ких │тара │ │Массовая концентрация │8,0 - 11,0 │ГОСТ 14252-73│ │сортов │ │ │титруемых кислот (в │ │ │ │ │ │ │пересчете на винную │ │ │ │ │ │ │кислоту), г/куб. дм │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │Отстаи- │Отстойный│Каждая │Массовая концентрация │50 │ГОСТ 14351-73│ │вание │резервуар│партия │общей сернистой │ │ │ │сусла с │ │ │кислоты, мг/куб. дм, │ │ │ │охлаж- │ │ │не более │ │ │ │дением │ │ │Температура, °С │10 - 12 │Термометры │ │ │ │ │ │ │технические │ │ │ │ │ │ │по ГОСТ │ │ │ │ │ │ │28498-90 с │ │ │ │ │ │ │диапазоном │ │ │ │ │ │ │измерения от │ │ │ │ │ │ │0 до 100 °С с│ │ │ │ │ │ │ценой деления│ │ │ │ │ │ │1 °С │ │ │ │ │Степень осветления │Фактич. │Визуально │ │ │ │ │ │ │ │ │Разводка│Дрожжевые│Ежедневно│Массовая концентрация │6,0 - 8,0 │ГОСТ 13192-73│ │дрожжей │аппараты │ │сахаров, г/куб. дм │ │ │ │чистой │ │ │Микробиологическое │30 - 60 │Инструкция по│ │культуры│ │ │состояние, │ │микробиоло- │ │ │ │ │концентрация дрожжевых│ │гическому │ │ │ │ │клеток, млн./куб. см │ │контролю │ │ │ │ │ │ │шампанских и │ │ │ │ │ │ │игристых вин │ │ │ │ │Температура, °С │18 - 20 │Термометры │ │ │ │ │ │ │технические │ │ │ │ │ │ │по ГОСТ │ │ │ │ │ │ │28498-90 с │ │ │ │ │ │ │диапазоном │ │ │ │ │ │ │измерения от │ │ │ │ │ │ │0 до 100 °С с│ │ │ │ │ │ │ценой деления│ │ │ │ │ │ │1 °С │ │ │ │ │ │ │ │ │Брожение│Бродиль- │Ежедневно│Массовая концентрация │Фактич. │ГОСТ 13192-73│ │сусла │ные ре- │ │сахаров, г/куб. дм │ │ │ │ │зервуары │ │Микробиологическое │Фактич. │Инструкция по│ │ │ │ │состояние дрожжевых │ │микробиоло- │ │ │ │ │клеток │ │гическому │ │ │ │ │ │ │контролю │ │ │ │ │ │ │шампанских и │ │ │ │ │ │ │игристых вин │ │ │ │ │Температура, °С │Оптимально │Термометры │ │ │ │ │ │15 - 18, но│технические │ │ │ │ │ │не выше 22 │по ГОСТ │ │ │ │ │ │ │28498-90 с │ │ │ │ │ │ │диапазоном │ │ │ │ │ │ │измерения от │ │ │ │ │ │ │0 до 100 °С с│ │ │ │ │ │ │ценой деления│ │ │ │ │ │ │1 °С │ │ │ │ │ │ │ │ │Винома- │Транс- │Каждая │Объемная доля │9,5 - 12,0 │ГОСТ 13191-73│ │териалы │портная │партия │этилового спирта, % │ │ │ │шампанс-│тара или │ │Массовая концентрация │3,0 │ГОСТ 13192-73│ │кие │производ-│ │сахаров, г/куб. дм, не│ │ │ │ │ственный │ │более │ │ │ │ │резервуар│ │Массовая концентрация │6,0 - 10,0 │ГОСТ 14252-73│ │ │ │ │титруемых кислот (в │ │ │ │ │ │ │пересчете на винную │ │ │ │ │ │ │кислоту), г/куб. дм │ │ │ │ │ │ │Массовая концентрация │0,8 │ГОСТ 13193-73│ │ │ │ │летучих кислот (в │ │ │ │ │ │ │пересчете на уксусную │ │ │ │ │ │ │кислоту), г/куб. дм, │ │ │ │ │ │ │не более │ │ │ │ │ │ │Массовая концентрация │100 │ГОСТ 14351-73│ │ │ │ │общей сернистой │ │ │ │ │ │ │кислоты, мг/куб. дм, │ │ │ │ │ │ │не более │ │ │ │ │ │ │в том числе свободной,│20 │ГОСТ 14351-73│ │ │ │ │мг/куб. дм, не более │ │ │ │ │ │ │Массовая концентрация │1 - 20 │ГОСТ 13195-73│ │ │ │ │железа, мг/куб. дм │ │ │ │ │ │ │Массовая концентрация │16 │ГОСТ 14251-75│ │ │ │ │приведенного │ │ │ │ │ │ │экстракта, г/куб. дм, │ │ │ │ │ │ │не менее │ │ │ │ │ │ │рН │2,8 - 3,4 │ГОСТ 26188-84│ │ │ │ │Микробиологическая │От "удов- │Инструкция по│ │ │ │ │характеристика │летвори- │микробиоло- │ │ │ │ │ │тельно" до │гическому │ │ │ │ │ │"хорошо" │контролю │ │ │ │ │ │ │шампанских и │ │ │ │ │ │ │игристых вин │ └────────┴─────────┴─────────┴──────────────────────┴───────────┴─────────────┘
8. Перечень дополнительной руководящей нормативной и технологической документации, необходимой для производства продукта
1. ГОСТ Р 51147-98 "Виноматериалы шампанские".
2. "Общие правила по переработке винограда на виноматериалы", утверждены МПП СССР 09.08.1967.
3. ГОСТы по контролю качества сырья и готовой продукции.
4. Инструкция по микробиологическому контролю производства шампанских и игристых вин.
ИНСТРУКЦИЯ
ПО ПРОИЗВОДСТВУ РОССИЙСКОГО ШАМПАНСКОГО
Настоящая технологическая инструкция распространяется на производство Российского шампанского по ГОСТ 13918-88 на предприятиях, расположенных на территории Российской Федерации, путем насыщения двуокисью углерода эндогенного происхождения в процессе вторичного брожения шампанских виноматериалов в герметических резервуарах под давлением.
1. Общие правила
1.1. Для приготовления Российского шампанского используют три метода шампанизации:
шампанизация в стеклянных бутылках (бутылочный);
шампанизация в потоке в специальных аппаратах-резервуарах (резервуарный непрерывный);
шампанизация периодическая в специальных аппаратах-резервуарах (резервуарный периодический).
2. Характеристика готовой продукции
2.1. По органолептическим показателям Российское шампанское должно соответствовать требованиям, представленным в табл. 1.
Таблица 1
┌─────────────┬──────────────────────────────────────────────────┐ │ Показатель │ Характеристика │ ├─────────────┼──────────────────────────────────────────────────┤ │Прозрачность │Прозрачное без осадка и посторонних включений │ │Цвет │Светло-соломенный с оттенками от зеленоватого │ │ │до золотистого │ │Букет │Развитой, тонкий, свойственный методу производства│ │ │шампанского │ │Вкус │Гармоничный, соответствующий шампанским винам, без│ │ │явных тонов окисленности и любых других │ │ │несвойственных винам этого типа оттенков │ │Игристые │При наливе в бокал должна образовываться пена │ │свойства │и происходить длительное выделение пузырьков │ │ │двуокиси углерода │ └─────────────┴──────────────────────────────────────────────────┘
2.2. По химическим показателям Российское шампанское должно соответствовать требованиям, приведенным в табл. 2.
Таблица 2
┌──────────────────────────────────────────┬──────────────┐ │ Показатель │ Значение │ ├──────────────────────────────────────────┼──────────────┤ │Объемная доля этилового спирта, % │10,5 - 12,5 │ │Массовая концентрация сахаров, г/куб. дм │ │ │ брют, не более │15,0 │ │ сухое │20,0 - 25,0 │ │ полусухое │40,0 - 45,0 │ │ полусладкое │60,0 - 65,0 │ │ сладкое │80,0 - 85,0 │ └──────────────────────────────────────────┴──────────────┘
Остальные химические и физико-химические показатели по ГОСТ 13918-88.
3. Характеристика сырья и материалов
3.1. Для производства Российского шампанского применяют шампанские виноматериалы по ГОСТ Р 51147-98.
Остальные сырье и материалы должны соответствовать ГОСТ 13918-88.
4. Описание технологических процессов
4.1. Обработка шампанских виноматериалов и их купажирование
Обработка шампанских виноматериалов предусматривает подготовку их к шампанизации. С этой целью их необходимо освободить от избыточного содержания железа и достичь их розливостойкости, а также скупажировать виноматериалы различных ампелографических сортов с целью формирования необходимых органолептических достоинств будущего вина.
4.1.1. Обработку шампанских виноматериалов производят на заводах (в цехах) шампанских вин.
Поступившие на завод шампанские виноматериалы прежде всего подвергают полному химическому и микробиологическому анализу и органолептической оценке. Виноматериалы, не отвечающие предъявляемым требованиям, отбраковывают и в производство шампанского не допускают.
Принятые виноматериалы сразу же, но не позднее 15 сут., направляют на ассемблирование, т.е. объединение их в крупные однородные партии в пределах сорта одного или разных хозяйств-поставщиков, желательно единой сырьевой зоны.
В процессе ассамблирования проводят обработку их желтой кровяной солью (железистосинеродистым калием) и рыбным клеем (при необходимости с танизацией) или бентонитом.
Обработку шампанских виноматериалов желтой кровяной солью проводят при содержании железа более 4 мг/куб. дм (в пересчете на 3-валентное железо) и осуществляют в соответствии с Инструкцией по обработке вина желтой кровяной солью.
4.1.2. При обработке ассамблированных виноматериалов рекомендуется следующий порядок: в виноматериал задают танин, на следующий день вносят желтую кровяную соль, а затем (не ранее чем через 4 ч) - рыбный клей или бентонит.
Виноматериал тщательно перемешивают в процессе внесения указанных компонентов до равномерного их распределения.
Танин вводят в виноматериал в виде 10%-ного раствора в ректификованном спирте или обработанном купаже, желтую кровяную соль - в виде водного раствора, рыбный клей - 0,5 - 1,0%-ного раствора в купаже, бентонит - 20%-ной водной суспензии.
Дозировку танина, желтой кровяной соли, рыбного клея и бентонита, вносимых в виноматериал, определяют на основании пробных оклеек.
4.1.3. Обработанный ассамблированный виноматериал осветляют одним из следующих способов:
- центрифугированием (сепарированием), которое проводят через сутки после внесения желтой кровяной соли и оклеивающих веществ; в случае необходимости после центрифугирования вино подвергают фильтрации;
- отстаиванием до осветления, которое проводится в той же емкости, где проводилась обработка, или в другом резервуаре; продолжительность - не более 20 сут. со времени внесения желтой кровяной соли.
4.1.4. Осветлившийся методом отстаивания виноматериал декантируют с выпавших осадков (при необходимости с фильтрацией). Жидкие осадки, полученные при декантации, фильтруют. Фильтрат присоединяют к основной массе ассамблированного виноматериала, а отпрессованные осадки передают на утилизацию или захоронение (если они содержат берлинскую лазурь). Жидкие осадки рекомендуется перерабатывать непосредственно после отделения от виноматериала, не допуская длительного хранения.
Обработанные розливостойкие ассамблированные виноматериалы направляют на купажирование или в резерв.
4.1.5. Производственные купажи составляют на основании результатов пробных купажей, получивших положительное заключение дегустационной комиссии предприятия. При составлении пробных купажей учитывают требования, предъявляемые к химическим, физико-химическим и органолептическим показателям шампанского.
Рекомендуется вводить в состав купажа до 20% высококачественных виноматериалов, выдержанных в течение 1 - 2 лет.
4.1.6. Операцию купажирования осуществляют в потоке или периодическим методом. Ассамблированные сортовые виноматериалы в соотношении согласно пробному купажу направляют в крупную емкость, оборудованную перемешивающим устройством.
В случае необходимости (по заключению лаборатории предприятия) купаж оклеивают рыбным клеем. Дозировку вносимого рыбного клея устанавливают на основании пробной оклейки.
При купажировании и внесении оклеивающих веществ виноматериалы перемешивают с целью равномерного распределения компонентов.
4.1.7. Купаж виноматериалов, неоклеенный рыбным клеем, фильтруют. Купаж виноматериалов с внесенным рыбным клеем осветляют центрифугированием или отстаиванием с последующей декантацией. Центрифугирование проводят через сутки после внесения рыбного клея, а отстаивание - до осветления, но не позднее чем через 15 сут. При необходимости проводят дополнительную фильтрацию. При декантации без фильтрации осадок отфильтровывают и присоединяют к основной массе купажа.
4.1.8. При равномерном поступлении виноматериалов в течение года в установленном сортовом ассортименте допускается совмещение операций ассамблирования и купажирования с необходимой обработкой с целью осветления виноматериалов, осуществляемой в потоке.
4.1.9. Осветленные купажи после месячной выдержки в стационарных условиях или в потоке направляют на резервное хранение или обескислороживание с обработкой холодом.
4.1.10. Обработку купажа холодом проводят в процессе хранения или непосредственно перед шампанизацией. Купаж охлаждают до температуры не ниже -3 °С и выдерживают 1 - 2 сут., а затем фильтруют при температуре охлаждения.
4.2. Приготовление ликеров
4.2.1. Для применения в производстве шампанского готовят следующие ликеры:
- тиражный и экспедиционный - в производстве шампанского бутылочным методом;
- резервный и экспедиционный - в производстве шампанского резервуарным методом.
4.2.2. Для приготовления ликеров используют обработанные розливостойкие шампанские виноматериалы, сахарозу, коньячный спирт и винный дистиллят (для экспедиционного ликера), лимонную кислоту.
4.2.3. Ликеры готовят на следующих виноматериалах:
тиражный и резервуарный ликер - на купажах, приготовленных для шампанизации;
экспедиционный ликер для резервуарного шампанского - на высококачественных обработанных купажах. Рекомендуется готовить ликер на виноматериалах, выдержанных 1 - 2 года в условиях, исключающих их окисление;
экспедиционный ликер для коллекционного шампанского - на высококачественных виноматериалах, выдержанных 2,5 - 3 года.
4.2.4. Ликеры для производства шампанского должны соответствовать требованиям, указанным в табл. 3.
Таблица 3
┌────────────────┬─────────────┬───────────┬─────────────────────┐ │ Ликер │ Массовая │ Объемная │Массовая концентрация│ │ │концентрация │ доля │ титруемых кислот (в │ │ │ сахара, │ этилового │ пересчете на винную │ │ │ г/куб. дм │ спирта, % │ кислоту), г/куб. дм │ ├────────────────┼─────────────┼───────────┼─────────────────────┤ │Тиражный и │500 - 600 │- │- │ │резервуарный │ │ │ │ │Экспедиционный │700 - 800 │10,5 - 11,5│6 - 8 │ └────────────────┴─────────────┴───────────┴─────────────────────┘
Примечание. Объемная доля этилового спирта и массовая концентрация титруемых кислот тиражного и резервуарного ликеров не нормируются.
4.2.5. Тиражный и резервуарный ликеры готовят путем растворения сахарозы в купаже при тщательном перемешивании компонентов. Полученный ликер фильтруют и направляют на выдержку. Рекомендуется проводить выдержку отфильтрованного резервуарного ликера с разводкой дрожжей чистой культуры, которая вносится в концентрированном виде из расчета содержания не менее 15 млн. клеток дрожжей в 1 куб. см ликера для повышения его биологической ценности.
4.2.6. Экспедиционные ликеры готовят путем растворения сахара в купаже или ассамбляже виноматериалов при тщательном перемешивании компонентов. После растворения сахара вносят коньячный спирт или винный дистиллят и лимонную кислоту из расчета получения объемной доли этилового спирта и массовой концентрации титруемых кислот в соответствии с табл. 3.
Допускается приготовление экспедиционного ликера с использованием высокоспиртуозных виноматериалов, без внесения коньячного спирта или винного дистиллята.
Рекомендуется вносить сернистый ангидрид из расчета 25 - 30 мг/куб. дм шампанского.
После перемешивания всех внесенных компонентов экспедиционный ликер фильтруют и направляют на выдержку.
4.2.7. Минимальные сроки выдержки ликеров, сут.: тиражного - 10, резервуарного - 30, экспедиционного - 100.
Выдержку ликеров осуществляют периодическим методом или в непрерывном, пульсирующем потоке.
4.2.8. Перед использованием в производстве ликеры при необходимости фильтруют; в экспедиционный ликер рекомендуется вносить сернистый ангидрид из расчета 20 - 25 мг/куб. дм.
4.3. Приготовление разводок дрожжей чистой культуры
4.3.1. Расы дрожжей, применяемые в производстве шампанского, должны ежегодно проверяться Отраслевой лабораторией технологии игристых вин ВНИИ ПБ и ВП.
4.3.2. Подготовку производственной разводки дрожжей чистой культуры начинают в лаборатории предприятия и осуществляют методом постепенного накопления биомассы дрожжей и повышения их физиологической активности путем последовательных пересевов на питательные среды.
4.3.3. Для первых четырех генераций дрожжей применяют единую питательную среду с объемной долей этилового спирта 10 - 11%, массовой концентрацией сахара 20 - 30 г/куб. дм и массовой концентрацией титруемых кислот 7 - 8 г/куб. дм.
4.3.4. Питательную среду для первых четырех генераций стерилизуют нагреванием до 85 - 90 °С и выдержкой при этой температуре 15 мин.
4.3.5. Дрожжи всех генераций размножают при температуре 15 - 18 °С и постоянном встряхивании.
4.3.6. Дрожжи размножают в пробирках с 10 куб. см питательной среды в каждой. В период бурного брожения (генерация 1) содержимое пробирок с декантацией переливают в колбы, заполненные 100 куб. см питательной среды (генерация 2).
В период бурного брожения генерацию 2 без надосадочной жидкости переносят в литровые колбы, содержащие 500 куб. см питательной среды (генерация 3), а содержимое последних - в 3-литровые колбы, содержащие 1700 куб. см питательной среды (генерация 4).
4.3.7. Дрожжевую разводку из 3-литровых колб в стадии бурного брожения переводят в дрожжевые аппараты. Полученную в этих аппаратах пятую генерацию дрожжей используют для приготовления производственных разводок.
4.3.8. Производственные разводки дрожжей готовят на обработанных купажированных виноматериалах и ликере. В качестве питательной среды может быть использована также бродильная смесь, не содержащая дрожжей, после тепловой обработки.
4.3.9. Питательную среду для приготовления дрожжевой разводки подвергают обеспложивающей фильтрации или пастеризации.
4.3.10. Используемый для аэрации среды воздух подвергают предварительной очистке.
4.3.11. Культивирование дрожжей гомогенно-непрерывным методом.
4.3.11.1. Разводку дрожжей чистой культуры готовят в одноемкостном аппарате, оборудованном перемешивающим, аэрирующим и пеногасящим устройством, а также системой для регулирования температуры культуральной жидкости.
4.3.11.2. Дозирование компонентов питательной среды (купажа или бродильной смеси и ликера) в аппарат производят раздельно. Количество подаваемого ликера устанавливают в зависимости от скорости потребления сахара дрожжами из расчета постоянного содержания его в культуральной жидкости в пределах 5 - 7 г/куб. дм. Одновременно вводят раствор аммиака из расчета постоянного содержания его в питательной среде 10 - 15 мг/куб. дм аммиачного азота.
4.3.11.3. Равномерное диспергирование дрожжевых клеток, а также устранение ценообразования обеспечивают непрерывной циркуляцией культуральной жидкости из нижней части аппарата в верхнюю, где она распыляется в наджидкостном пространстве через кольцевой перфорированный распылитель. Циркуляцию среды осуществляют центробежным насосом, обеспечивающим не менее чем 20-кратный оборот культуральной жидкости в час.
Перемешивать можно также установленной в аппарате мешалкой со скоростью 400 - 600 об./мин.
4.3.11.4. Среду аэрируют из расчета не более 0,3 куб. дм воздуха на 1 куб. дм культуральной жидкости в мин.
4.3.11.5. Размножение дрожжей проводят при температуре 18 - 20 °С.
4.3.11.6. Готовую дрожжевую разводку непосредственно из аппарата насосом-дозатором направляют на производство.
Разводку, направляемую на шампанизацию, рекомендуется предварительно адаптировать к условиям вторичного брожения. Адаптацию дрожжей проводят в течение 3 - 5 ч в специальном аппарате (активаторе) в анаэробных условиях при температуре и давлении, при которых осуществляют процесс шампанизации. Дрожжевую разводку на производственные цели отбирают из нижней части активатора.
4.3.11.7. Производительность установки принимают такой, при которой коэффициент потока составляет 0,015 - 0,02, что соответствует продолжительности процесса культивирования 2,5 - 2 сут.
4.3.12. Культивирование дрожжей градиентно-непрерывным методом.
4.3.12.1. Разводку дрожжей чистой культуры готовят в системе последовательно соединенных аппаратов, оборудованных перемешивающими и аэрирующими устройствами, а также системой для регулирования температуры культуральной жидкости.
4.3.12.2. Для культивирования дрожжей готовят питательную среду с содержанием сахара 20 - 40 г/куб. дм.
4.3.12.3. В пусковой период дрожжевые аппараты загружают последовательно от последнего к первому с интервалами 10 - 12 ч.
Пуск установки производят после загрузки всех аппаратов.
4.3.12.4. В первом дрожжевом аппарате обеспечивают активное размножение дрожжей при температуре не выше 15 °С, а в последующих температуру постепенно снижают. При этом в последнем дрожжевом аппарате поддерживают температуру не выше, чем у вина на выходе из установки.
4.3.12.5. В процессе культивирования дрожжей среду непрерывно аэрируют воздухом. При этом подачу воздуха постепенно уменьшают от первого аппарата к последнему, который не аэрируют. Удельный расход воздуха в первом аппарате поддерживают в пределах 0,6 - 0,8 куб. дм/ч на 1 куб. дм культуральной жидкости.
4.3.12.6. В целях повышения эффективности обмена веществ дрожжей осуществляют непрерывное перемешивание культуральной жидкости во всех аппаратах с таким расчетом, чтобы при этом обеспечивались десорбция углекислоты и равномерное диспергирование дрожжевых клеток.
4.3.12.7. Разводку дрожжей на производственные цели расходуют непосредственно из последнего дрожжевого аппарата.
4.3.13. Культивирование дрожжей периодическим методом.
4.3.13.1. Разводку дрожжей чистой культуры готовят в аппаратах, оборудованных перемешивающими и аэрирующими устройствами, а также системой для регулирования температуры культуральной жидкости.
4.3.13.2. Компоненты питательной среды (купажа с ликером или бродильной смеси) дозируют в аппарат раздельно. Количество подаваемого ликера устанавливают в зависимости от скорости потребления сахара дрожжами из расчета постоянного содержания его в культуральной жидкости в пределах 5 - 7 г/куб. дм. Одновременно вводят раствор аммиака из расчета 70 мг/куб. дм аммиачного азота.
4.3.13.3. Культуральную жидкость перемешивают различными методами:
- принудительной циркуляцией ее из нижней части аппарата в верхнюю;
- циркуляцией ее из нижней части аппарата в верхнюю, осуществляемую эрлифтом, сочетающим процесс перемешивания и аэрации;
- устройством, диспергирующим воздух через полую ось и перфорированные трубки или пластинки;
- механическими перемешивающими устройствами.
4.3.13.4. Аэрацию среды проводят из расчета не более 0,3 куб. дм воздуха на 1 куб. дм культуральной жидкости в мин.
4.3.13.5. При использовании дрожжевой разводки в производстве шампанского непрерывным методом аэрацию культуральной жидкости прекращают за 3 - 5 ч до направления ее на шампанизацию.
4.3.13.6. Дрожжи размножают при температуре не выше 18 °С.
4.3.13.7. Разводку дрожжей, направляемую на шампанизацию, рекомендуется предварительно адаптировать к температурным условиям вторичного брожения.
Адаптацию дрожжей проводят в том же аппарате.
4.3.13.8. Разводку дрожжей на производственные цели расходуют непосредственно из дрожжевого аппарата. После использования 70 - 75% разводки расход ее прекращают, аппарат вновь заполняют питательной средой и продолжают процесс культивирования дрожжей, как указано выше.
4.4. Обескислороживание купажей
Обескислороживание купажей проводят биологическим методом в непрерывном потоке.
4.4.1. Биологическое обескислороживание купажей осуществляют в вертикальных резервуарах, заполненных сорбентом на 75 - 80% их высоты. Купаж подают в резервуар непрерывно, одновременно с разводкой чистой культуры дрожжей из расчета содержания в смеси 2 - 3 млн./куб. см клеток дрожжей. Кислород практически полностью потребляется дрожжами в течение 3 - 5 ч, после чего усиливаются восстановительные процессы и купаж обогащается биологически активными веществами дрожжей. Обескислороживание купажа проводят при температуре не выше 12 °С.
4.4.2. В случае неблагоприятного расположения производственных площадей допускается обескислороживание купажей в системе последовательно соединенных горизонтальных резервуаров.
Общую вместимость резервуаров принимают из расчета не менее месячной выдержки купажей в пульсирующем потоке.
При проведении процесса в термостатированных условиях при температуре не выше 12 °С в первый резервуар установки рекомендуется вносить дрожжевую разводку в количестве 2 - 3 млн./куб. см дрожжевых клеток.
4.5. Шампанизация вина
Шампанизация вина всеми принятыми методами включает приготовление бродильной (тиражной) смеси, вторичное брожение в герметических резервуарах или бутылках, выдержку, обработку холодом, внесение при необходимости экспедиционного ликера.
4.5.1. Бутылочный метод шампанизации.
4.5.1.1. В резервуаре, снабженном перемешивающим устройством, готовят тиражную смесь, в которую входят обработанные розливостойкие купажи, тиражный ликер, разводка чистой культуры дрожжей, 2%-ный раствор рыбного клея и 10%-ный спиртовый раствор танина. Для создания лучшей структуры осадков вместо танина и рыбного клея рекомендуется использовать бентонит в виде 20%-ной водной суспензии.
Тиражный ликер вносят в смесь из расчета получения массовой концентрации сахара 22 - 24 г/куб. дм, разводку чистой культуры дрожжей - из расчета 1 млн./куб. см дрожжевых клеток.
Дозировки оклеивающих веществ устанавливаются лабораторией предприятия на основании пробной оклейки. При этом дозировка рыбного клея не должна превышать 0,0125 г/куб. дм, танина - 0,01 г/куб. дм, а бентонита - 0,2 г/куб. дм.
4.5.1.2. Порядок приготовления тиражной смеси следующий. В тиражный резервуар закачивают купаж виноматериалов, затем вносят раствор танина. После размешивания танина с виноматериалом задают рыбный клей, тиражный ликер и разводку чистой культуры дрожжей.
Тиражную смесь тщательно перемешивают и непосредственно перед розливом подвергают химическому и микробиологическому анализам. При положительном заключении лаборатории тиражную смесь разливают в бутылки. Тиражная смесь в процессе розлива должна иметь температуру 12 - 18 °С.
4.5.1.3. Тиражную смесь разливают в хорошо вымытые новые бутылки для шампанского при непрерывной работе перемешивающего устройства. Налив тиражной смеси в бутылки производят по уровню, который должен быть в пределах 7 +/- 1 см от верхнего края венчика горлышка бутылки.
4.5.1.4. Бутылки с тиражной смесью укупоривают тиражной пробкой, которую закрепляют металлической скобой. Рекомендуется укупоривать бутылки с тиражной смесью кроненпробкой.
4.5.1.5. После проверки качества укупорки бутылки с тиражной смесью направляют на брожение, которое рекомендуется проводить в помещении при температуре 10 - 12 °С.
Бутылки укладывают в штабели в горизонтальном положении по партиям тиража. Каждой партии тиража, приготовленной в одной тиражной емкости, присваивают номер, который сохраняют до выпуска шампанского. На штабелях вывешивают бирку с указанием номера партии, даты розлива тиража и количества бутылок данной партии в штабеле. При укладке бутылок в штабель специальной меткой отмечают положение газовой камеры.
Контроль хода брожения проводят не реже одного раза в 10 сут. Выбродившим считается вино, имеющее массовую концентрацию сахара не более 3 г/куб. дм. Полученное вино в дальнейшем называют кюве.
4.5.1.6. После брожения проводят выдержку кюве. Общая продолжительность брожения и выдержки, составляющая послетиражную выдержку, должна быть не менее 9 мес., считая от даты тиража. Оптимальная продолжительность послетиражной выдержки - три года.
В процессе выдержки бутылки с кюве перекладывают со взбалтыванием осадка. Обычно делают четыре перекладки: в первый год выдержки - две и в последующие годы - по одной.
Первую перекладку осуществляют после окончания брожения, но не позднее чем через 3 мес. после тиража.
При положительном заключении лаборатории предприятия о качестве осадков допускается вторую и третью перекладки не проводить. Последнюю перекладку совмещают с загрузкой бутылок в пюпитры для ремюажа.
4.5.1.7. Для улучшения структуры осадка и облегчения операции ремюажа рекомендуется после первой перекладки проводить обработку кюве холодом при температуре -2...-3 °С.
4.5.1.8. Выявленные при перекладках бутылки с утечкой вина (кулез) разделяют на малый кулез - утечка до 100 куб. см и большой кулез - 100 куб. см и более.
Малый кулез, выявленный при первой перекладке, и большой кулез, выявленный при последующих перекладках, подлежат сливу с использованием полученных виноматериалов в производстве в зависимости от их качества. Малый кулез, выявленный при второй и последующих перекладках, направляют сразу на ремюаж и дегоржаж.
4.5.1.9. После выдержки бутылки с кюве моют, взбалтывают и загружают в пюпитры для сведения осадка на пробку (ремюаж).
В помещениях, где проводят ремюаж, рекомендуется поддерживать постоянную температуру не выше 15 °С.
В случае наличия на стенках бутылок с шампанизируемым вином несмываемых сеток или масок проводят обработку холодом до появления в вине кристаллов льда, не допуская сплошного замораживания, затем бутылки энергично взбалтывают до удаления сеток и масок.
Для обеспечения ритмичной работы предприятия рекомендуется создавать резерв отремюированного шампанизированного вина и хранить его до дегоржажа в специальной укладке бутылок горлышком вниз ("Казье"). Отремюированное вино подается на дегоржаж - удаление осадка.
4.5.1.10. Собранный в процессе ремюажа на пробке осадок рекомендуется перед дегоржажем замораживать до образования льдинки.
Перед удалением осадка из бутылок мастер-дегоржер просматривает бутылку на контрольной лампочке. Бутылки с недостаточно осветлившимся вином, плохо сведенным на пробку осадком, масками и другими недостатками ремюажа дегоржажу не подлежат и передаются на повторную обработку после взбалтывания.
4.5.1.11. После удаления из бутылки осадка производят дозирование шампанского экспедиционным ликером. Количество вводимого в бутылку ликера определяют с учетом кондиций выпускаемого шампанского.
После введения экспедиционного ликера каждую бутылку шампанского доливают тем же вином и с таким расчетом, чтобы уровень шампанского в бутылке был в пределах 8 +/- 1 см от края венчика горлышка бутылки. Затем бутылки укупоривают экспедиционной корковой или полиэтиленовой пробкой, которую закрепляют уздечкой (мюзле).
В случае небольшого сброса шампанского при дегоржаже, перед задачей экспедиционного ликера производят необходимый отъем вина из бутылки, чтобы соблюсти необходимый уровень.
После дозирования шампанского экспедиционным ликером укупорки и взбалтывания бутылок продукцию подвергают бракеражу и укладывают в помещение с температурой 17 - 25 °С для контрольной выдержки. Укладку бутылок производят по партиям.
4.5.2. Резервуарный непрерывный метод шампанизации.
4.5.2.1. Шампанизацию вина резервуарным непрерывным методом осуществляют в системе последовательно соединенных резервуаров или в одноемкостном аппарате, либо в установке, работающей в условиях повышенной концентрации дрожжей.
4.5.2.2. Обескислороженный и обработанный холодом купаж при необходимости направляют на тепловую обработку при 50 - 60 °С с выдержкой при этой температуре в течение 5 - 24 ч. После тепловой обработки в купаж вносят резервуарный ликер из расчета получения массовой концентрации сахара в бродильной смеси 22 - 24 г/куб. дм. Бродильную смесь охлаждают до температуры 10 - 15 °С, фильтруют или сепарируют и направляют на вторичное брожение.
Перед поступлением в бродильную установку, состоящую из одного или нескольких резервуаров, в бродильную смесь вводят разводку дрожжей чистой культуры из расчета концентрации дрожжевых клеток 3 - 5 млн./куб. см.
4.5.2.3. Вторичное брожение вина в установках, не заполненных сорбентом, проводится при температуре не выше 15 °С, а в установках, заполненных сорбентом, - не выше 12 °С. При вторичном брожении должно быть сброжено не менее 18 г/куб. дм сахара. При этом следят за равномерностью сбраживания сахара. При вторичном брожении в условиях повышенной концентрации дрожжей установку шампанизации заполняют на 60 - 70% высоты сорбентом, предпочтительно дубовым или буковым.
4.5.2.4. При вторичном брожении в системе последовательно соединенных резервуаров или в одноемкостном аппарате, не заполненных сорбентом, выходящее шампанизированное вино направляют в биогенератор для обогащения его продуктами жизнедеятельности дрожжей.
4.5.2.5. По выходе из биогенератора шампанизированное вино подвергают охлаждению до температуры -3...-4 °С и направляют в термос-резервуары для выдержки, которую проводят при температуре охлаждения не менее 24 ч.
4.5.2.6. После выдержки на холоде шампанизированное вино фильтруют в изотермических условиях и направляют в приемные аппараты.
Вино, шампанизированное в условиях повышенной концентрации дрожжей, в связи с тем, что оно практически не содержит дрожжевых клеток, имеет кристальную прозрачность, при поступлении в приемные аппараты его не фильтруют.
Дозирование вина экспедиционным ликером до требуемой массовой концентрации сахара производят одним из принятых способов.
В приемных аппаратах шампанское выдерживают не менее 6 ч, после чего направляют на розлив в бутылки. В случае необходимости шампанское перед подачей на розлив фильтруют.
4.5.2.7. Перед загрузкой бродильные аппараты и биогенератор промывают 1,5 - 2,0%-ным раствором кальцинированной соды, горячей и холодной водой. При этом проверяют также количество внутреннего защитного покрытия емкостей из углеродистой стали.
Принятые микробиологом аппараты на чистоту мойки подвергают гидравлическому испытанию на герметичность. После гидравлического испытания аппараты установки и коммуникации стерилизуют 0,2%-ным раствором сернистой кислоты в течение 2 - 3 ч. Затем установку промывают холодной водой до полного удаления сернистой кислоты. Оставшуюся в аппаратах и коммуникациях воду вытесняют двуокисью углерода.
4.5.2.8. Первоначальную загрузку бродильной установки начинают с биогенератора при его наличии в установке, а систему последовательно соединенных резервуаров - от последнего к первому с интервалами 2 - 3 сут. (после сбраживания 2 - 3 г/куб. дм сахара). Загрузку бродильных аппаратов всех систем производят бродильной смесью с массовой концентрацией сахара 22 г/куб. дм и дрожжевых клеток 2 - 3 млн./куб. см смеси, аналогично загрузке при периодическом методе шампанизации.
4.5.2.9. При вторичном брожении в системе последовательно соединенных резервуаров приступают к непосредственной подготовке установки к пуску после выбраживания в последнем бродильном резервуаре и биогенераторе шампанизированного вина до требуемой массовой концентрации сахара, а также забраживания в первом бродильном аппарате.
При подготовке установки к пуску потока, коммуникации бродильной смеси и дрожжевой разводки подсоединяют к первому бродильному аппарату, заполняют расходные емкости резервуарным и экспедиционными ликерами. Затем в бродильных аппаратах и биогенераторе ликвидируют газовые камеры. Для этого бродильную смесь и дрожжевую разводку подают в первый бродильный аппарат или одноемкостный аппарат до полного заполнения и повышения давления до 500 кПа. Аналогичную операцию проводят последовательно в других аппаратах и биогенераторе.
Далее создают необходимое углекислотное противодавление в приемных аппаратах, которое должно быть на 2 - 30 кПа выше давления, равновесного концентрации двуокиси углерода в шампанизируемом вине. После выполнения указанных операций осуществляют пуск потока открытием вентиля перед теплообменным аппаратом.
4.5.2.10. Первоначальную загрузку бродильной установки, работающей в условиях повышенной концентрации дрожжей, и подготовку ее к пуску потока осуществляют в соответствии с требованиями, изложенными в пп. 4.5.2.7 - 4.5.2.9.
4.5.3. Резервуарный периодический метод шампанизации.
4.5.3.1. Бродильную смесь готовят из розливостойких обработанных купажей шампанских виноматериалов, резервуарного ликера и разводки дрожжей чистой культуры.
Массовая концентрация сахара в бродильной смеси зависит от марки
выпускаемого шампанского (г/куб. дм):
брют, не более 30
сухое 42
полусухое 62
полусладкое 82
сладкое 102.Разводку дрожжей чистой культуры вносят из расчета содержания в смеси 2 - 3 млн./куб. см клеток дрожжей.
Бродильную смесь подвергают химическому и микробиологическому анализам. После положительного заключения лаборатории бродильную смесь направляют на шампанизацию в бродильные резервуары. При этом ее температура не должна превышать 18 °С. Газовую камеру в бродильном резервуаре оставляют размером не более 1% его вместимости.
4.5.3.2. Для улучшения качества шампанского рекомендуется проводить следующие технологические операции.
Перед приготовлением бродильной смеси обескислороженный купаж подвергают тепловой обработке при температуре 55 - 60 °С в течение 12 - 24 ч. После тепловой обработки вводят резервуарный ликер. Смесь охлаждают до температуры 15 - 18 °С, вносят разводку чистой культуры дрожжей, тщательно перемешивают и направляют на вторичное брожение.
При положительном заключении микробиолога производят загрузку бродильного резервуара на дрожжи, оставшиеся от предыдущей шампанизации.
Проводят вторичное брожение на брют с последующим дозированием шампанизированного вина экспедиционным ликером до требуемой массовой концентрации сахара.
4.5.3.3. Вторичное брожение проводят при температуре 15 °С. Суточный прирост давления во время брожения, начиная с 80 кПа, не должен превышать 30 кПа.
4.5.3.4. Продолжительность шампанизации вина устанавливается 25 сут., в том числе брожения не менее 20 сут. Началом брожения считают отрыв стрелки манометра от первоначального положения.
4.5.3.5. В процессе вторичного брожения должно быть сброжено не менее 18 г/куб. дм сахара и достигнуто давление в бродильном резервуаре не менее 450 кПа при 20 °С.
При соблюдении указанных условий и достижении требуемой массовой концентрации сахара шампанизированное вино брют и сухое охлаждают до температуры -3...-4 °С, а полусухое, полусладкое и сладкое - до -4...-5 °С. Охлаждение вина производят за время не более 18 ч, после чего его выдерживают при температуре охлаждения не менее 48 ч.
4.5.3.6. После обработки холодом и проверки кондиционности шампанское подают на фильтрацию и розлив.
Допускается фильтровать шампанское в другой, заранее охлажденный, резервуар при температуре не выше -3 °С. В этом случае в приемном резервуаре отфильтрованное шампанское отстаивают не менее 6 ч при той же температуре и давлении не менее 350 кПа, после чего подают на розлив без фильтрации.
5. Розлив, упаковка, хранение и транспортирование
5.1. Розлив, укупоривание, оформление бутылок, хранение, упаковка и транспортирование Российского шампанского осуществляют в соответствии с ГОСТ 13918-88.
5.2. Розлив шампанского в бутылки проводят при поддержании постоянного давления в розливной машине не менее 200 кПа и температуре не выше -1 °С. В процессе розлива в приемном аппарате, из которого производят розлив, поддерживают требуемое давление с помощью баллонной двуокиси углерода.
5.3. После налива шампанского в бутылки и укупорки продукцию подвергают тепловой обработке при температуре 40 - 50 °С в течение 30 - 40 мин., затем охлаждают до 20 - 25 °С и направляют на внешнее оформление.
5.4. При отсутствии установок для тепловой обработки продукции бутылки с шампанским укладывают по партиям на контрольную выдержку, которую проводят при температуре 17 - 25 °С. Продолжительность контрольной выдержки при указанной температуре не менее 5 сут., при бутылочном методе шампанизации - 10 сут.
5.5. Российское шампанское, прошедшее контрольную выдержку и удовлетворяющее требованиям ГОСТ Р 51144-98 и настоящей инструкции, направляют на оформление бутылок, упаковку и затем на реализацию. Датой выпуска вина считается обозначенная дата отделки.
6. Требования к технологическому оборудованию
6.1. Для производства Российского шампанского применяют технологическое оборудование винодельческой промышленности.
7. Правила приемки
7.1. Правила приемки должны соответствовать ГОСТ Р 51144-98.
8. Краткое описание методов и средств контроля технологического процесса, сырья и готовой продукции
См. таблицу.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ МЕТОДОВ И СРЕДСТВ КОНТРОЛЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА, СЫРЬЯ И ГОТОВОЙ ПРОДУКЦИИ
┌──────────┬─────────┬─────────┬───────────────────────┬────────────┬──────────────┐ │ Объект │ Место │Периодич-│Контролируемый параметр│ Предельное │ Место и │ │ контроля │контроля │ность │ │ значение │ средство │ │ │ │контроля │ │ параметра │ контроля │ ├──────────┼─────────┼─────────┼───────────────────────┼────────────┼──────────────┤ │Винома- │Транс- │Каждая │Объемная доля этилового│9,5 - 12,0 │ГОСТ 13191-73 │ │териалы │портная │партия │спирта, % │ │ │ │шампанские│тара или │ │Массовая концентрация │3,0 │ГОСТ 13192-73 │ │ │производ-│ │сахаров, г/куб. дм, │ │ │ │ │ственный │ │не более │ │ │ │ │резервуар│ │Массовая концентрация │6,0 - 10,0 │ГОСТ 14252-73 │ │ │ │ │титруемых кислот │ │ │ │ │ │ │(в пересчете на винную │ │ │ │ │ │ │кислоту), г/куб. дм │ │ │ │ │ │ │Массовая концентрация │0,8 │ГОСТ 13193-93 │ │ │ │ │летучих кислот (в │ │ │ │ │ │ │пересчете на уксусную │ │ │ │ │ │ │кислоту), г/куб. дм, │ │ │ │ │ │ │не более │ │ │ │ │ │ │Массовая концентрация │100 │ГОСТ 14351-73 │ │ │ │ │общей сернистой │ │ │ │ │ │ │кислоты, мг/куб. дм, │ │ │ │ │ │ │не более │ │ │ │ │ │ │в том числе свободной, │20 │ГОСТ 14351-73 │ │ │ │ │мг/куб. дм, не более │ │ │ │ │ │ │Массовая концентрация │1 - 20 │ГОСТ 13195-73 │ │ │ │ │железа, мг/куб. дм │ │ │ │ │ │ │Массовая концентрация │16 │ГОСТ 14251-75 │ │ │ │ │приведенного экстракта,│ │ │ │ │ │ │г/куб. дм, не менее │ │ │ │ │ │ │рН │2,8 - 3,4 │ГОСТ 26188-84│ │ │ │ │Микробиологическая │От "удовлет-│Инструкция по│ │ │ │ │характеристика │ворительно" │микробиологи- │ │ │ │ │ │до "хорошо" │ческому │ │ │ │ │ │ │контролю │ │ │ │ │ │ │шампанских и │ │ │ │ │ │ │игристых вин │ │ │ │ │ │ │ │ │Производ- │Купажный │В каждой │Объемная доля этилового│10,0 - 11,2 │ГОСТ 13191-73 │ │ственный │резервуар│партии │спирта, % │ │ │ │купаж │ │ │Массовая концентрация │2,0 │ГОСТ 13192-73 │ │ │ │ │сахаров, г/куб. дм, │ │ │ │ │ │ │не более │ │ │ │ │ │ │Массовая концентрация │6,0 - 7,5 │ГОСТ 14252-73 │ │ │ │ │титруемых кислот │ │ │ │ │ │ │(в пересчете на винную │ │ │ │ │ │ │кислоту), г/куб. дм │ │ │ │ │ │ │Массовая концентрация │0,8 │ГОСТ 13193-73 │ │ │ │ │летучих кислот (в │ │ │ │ │ │ │пересчете на уксусную │ │ │ │ │ │ │кислоту), г/куб. дм, │ │ │ │ │ │ │не более │ │ │ │ │ │ │Массовая концентрация │100 │ГОСТ 14351-73 │ │ │ │ │общей сернистой │ │ │ │ │ │ │кислоты, мг/куб. дм, │ │ │ │ │ │ │не более │ │ │ │ │ │ │в том числе свободной, │10 │ГОСТ 141351-73│ │ │ │ │мг/куб. дм, не более │ │ │ │ │ │ │Розливостойкость │Розливо- │ТИ 10-84-94 │ │ │ │ │ │стойкий │ │ │ │ │ │ │ │ │ │Бродильная│Производ-│В каждой │Массовая концентрация │ │ │ │смесь │ственный │партии │сахаров, г/куб. дм: │ │ │ │ │резервуар│ │ непрерывный метод │22 - 24 │ГОСТ 13192-73 │ │ │ │ │ периодический метод │22 - 102 │ГОСТ 13192-73 │ │ │ │ │Температура, °С │10 - 15 │Термометры │ │ │ │ │ │ │технические по│ │ │ │ │ │ │ГОСТ 28498-90 │ │ │ │ │ │ │с диапазоном │ │ │ │ │ │ │измерений от 0│ │ │ │ │ │ │до 100 °С с │ │ │ │ │ │ │ценой деления │ │ │ │ │ │ │1 °С │ │ │ │ │Массовая концентрация │100 │ГОСТ 14351-73 │ │ │ │ │общей сернистой │ │ │ │ │ │ │кислоты, мг/куб. дм, │ │ │ │ │ │ │не более │ │ │ │ │ │ │в том числе свободной, │10 │ГОСТ 14351-73 │ │ │ │ │мг/куб. дм, не более │ │ │ │ │ │ │Концентрация дрожжевых │2,0 - 5,0 │Инструкция по │ │ │ │ │клеток, млн./куб. см │ │микробиологи- │ │ │ │ │ │ │ческому │ │ │ │ │ │ │контролю │ │ │ │ │ │ │шампанских и │ │ │ │ │ │ │игристых вин │ │ │ │ │ │ │ │ │Тиражная │Производ-│В каждой │Массовая концентрация │22,0 - 24,0 │ГОСТ 13192-73 │ │смесь │ственный │партии │сахаров, г/куб. дм │ │ │ │ │резервуар│ │Массовая концентрация │10 │ГОСТ 14351-73 │ │ │ │ │свободной сернистой │ │ │ │ │ │ │кислоты, мг/куб. дм, │ │ │ │ │ │ │не более │ │ │ │ │ │ │Концентрация дрожжевых │1,0 │Инструкция по│ │ │ │ │клеток, млн./куб. см │ │микробиологи- │ │ │ │ │ │ │ческому │ │ │ │ │ │ │контролю │ │ │ │ │ │ │шампанских и │ │ │ │ │ │ │игристых вин │ │ │ │ │ │ │ │ │Разводка │Дрожжевые│Ежедневно│Массовая концентрация │6,0 - 8,0 │ГОСТ 13192-73 │ │дрожжей │аппараты │ │сахаров, г/куб. дм │ │ │ │чистой │ │ │Микробиологическое │30 - 60 │Инструкция по│ │культуры │ │ │состояние, концентрация│ │микробиологи- │ │ │ │ │дрожжевых клеток, │ │ческому │ │ │ │ │млн./куб. см │ │контролю │ │ │ │ │ │ │шампанских и │ │ │ │ │ │ │игристых вин │ │ │ │ │Температура, °С │18 - 20 │Термометры по │ │ │ │ │ │ │ГОСТ 28498-90 │ │ │ │ │ │ │ │ │Резервуар-│Производ-│В каждой │Массовая концентрация │500 - 600 │ГОСТ 13192-73 │ │ный ликер │ственный │партии │сахаров, г/куб. дм │ │ │ │ │резервуар│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │Тиражный │Производ-│В каждой │Массовая концентрация │500 - 600 │ГОСТ 13192-73 │ │ликер │ственный │партии │сахаров, г/куб. дм │ │ │ │ │резервуар│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │Экспеди- │Производ-│В каждой │Массовая концентрация │700 - 800 │ГОСТ 13192-73 │ │ционный │ственный │партии │сахаров, г/куб. дм │ │ │ │ликер │резервуар│ │Объемная доля этилового│10,5 - 11,5 │ГОСТ 13191-73 │ │ │ │ │спирта, % │ │ │ │ │ │ │Массовая концентрация │6,0 - 8,0 │ГОСТ 14252-73 │ │ │ │ │титруемых кислот (в │ │ │ │ │ │ │пересчете на винную │ │ │ │ │ │ │кислоту), г/куб. дм │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │Шампаниза-│Бродиль- │Один раз │Массовая концентрация │22 (24) - │ГОСТ 13192-73 │ │ция непре-│ные │в 20 сут.│сахаров, г/куб. дм │2,0 │ │ │рывным │аппараты │Ежедневно│Давление, кПа │450 - 500 │Манометры │ │методом │ │ │Температура, °С, не │12 │Термометры по │ │ │ │ │более │ │ГОСТ 28498-90 │ │ │ │ │ │ │ │ │Шампаниза-│Бродиль- │Не менее │Массовая концентрация │Факт. │ГОСТ 13192-73 │ │ция перио-│ные │2 раз за │сахаров, г/куб. дм │ │ │ │дическим │аппараты │период │Давление, кПа │Факт. │Манометры │ │методом │ │вторич- │Температура, °С, не │15 │Термометры по │ │ │ │ного │более │ │ГОСТ 28498-90 │ │ │ │брожения │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │Шампаниза-│Бутылки с│В каждой │Массовая концентрация │Факт. │ГОСТ 13192-73 │ │ция буты- │кюве │партий на│сахаров, г/куб. дм │ │ │ │лочным │ │10-й, │Давление, кПа при 20 °С│Факт. │ГОСТ 12258-79 │ │методом │ │20-й, │ │ │ │ │ │ │30-й и │ │ │ │ │ │ │40-й │ │ │ │ │ │ │день │ │ │ │ │ │ │брожения │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │Обработка │Термос- │Ежедневно│Температура, °С │-2...-4 │Термометры │ │шампанизи-│резер- │ │ │ │технические по│ │рованного │вуары │ │ │ │ГОСТ 28498-90 │ │вина │ │ │ │ │с диапазоном │ │холодом │ │ │ │ │измерения от │ │ │ │ │ │ │0 до -38 °С с │ │ │ │ │ │ │ценой деления │ │ │ │ │ │ │0,5 °С │ │ │ │ │Давление, кПа │450 - 500 │Манометры │ │ │ │ │ │ │ │ │Обработка │Бутылки │В каждой │Температура, °С │-1...-3 │Термометры по│ │кюве │ │партии │ │ │ГОСТ 28498-90 │ │холодом │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │Готовая │Приемные │Каждая │Объемная доля этилового│10,5 - 12,5 │ГОСТ 13191-73 │ │продукция │резер- │партия │спирта, % │ │ │ │ │вуары или│ │Массовая концентрация │ │ │ │ │бутылки │ │сахаров, г/куб. дм: │ │ │ │ │ │ │ брют, не более │15,0 │ГОСТ 13192-73 │ │ │ │ │ сухое │20,0 - 25,0 │-"- │ │ │ │ │ полусухое │40,0 - 45,0 │-"- │ │ │ │ │ полусладкое │60,0 - 65,0 │-"- │ │ │ │ │ сладкое │80,0 - 85,0 │-"- │ │ │ │ │Массовая концентрация │16,0 │ГОСТ 14251-75 │ │ │ │ │приведенного экстракта,│ │ │ │ │ │ │г/куб. дм, не менее │ │ │ │ │ │ │Массовая концентрация │5,5 - 8,0 │ГОСТ 14252-73 │ │ │ │ │титруемых кислот │ │ │ │ │ │ │(в пересчете на винную │ │ │ │ │ │ │кислоту), г/куб. дм │ │ │ │ │ │ │Массовая концентрация │200 │ГОСТ 14352-73 │ │ │ │ │общей сернистой │ │ │ │ │ │ │кислоты, мг/куб. дм, не│ │ │ │ │ │ │более │ │ │ │ │ │ │Массовая концентрация │10 │ГОСТ 13195-73 │ │ │ │ │железа, мг/куб. дм │ │ │ │ │ │ │Разливостойкость вина в│Розливо- │ТИ 10-84-94 │ │ │ │ │приемном резервуаре │стойкое │ │ │ │ │ │Микробиологическая │От "удовлет-│Инструкция по │ │ │ │ │характеристика вина в │ворительно" │микробиологи- │ │ │ │ │бутылке │до "хорошо" │ческому │ │ │ │ │ │ │контролю │ │ │ │ │ │ │шампанских и │ │ │ │ │ │ │игристых вин │ │ │ │ │Давление двуокиси │350 │ГОСТ 12258-79 │ │ │ │ │углерода в бутылке при │ │ │ │ │ │ │20 °С, кПа, не менее │ │ │ │ │ │ │Полнота налива вина в │Уровень в │ГОСТ 23943-80 │ │ │ │ │бутылке │бутылке в │ │ │ │ │ │ │пределах │ │ │ │ │ │ │8 +/- 1 см │ │ │ │ │ │ │от края │ │ │ │ │ │ │венчика │ │ │ │ │ │ │бутылки │ │ │ │ │Периоди- │Токсичные элементы, │В пределах, │ГОСТ 26927-86 │ │ │ │чески по │ртуть, мышьяк, свинец, │установлен- │ГОСТ 26929-94 │ │ │ │согласо- │кадмий и радионуклиды │ных в Гигие-│ГОСТ 26930-86 │ │ │ │ванию с │ │нических │ГОСТ 26932-86 │ │ │ │местными │ │требованиях │ГОСТ 26933-86 │ │ │ │органами │ │к качеству и│ │ │ │ │ │ │безопасности│ │ │ │ │ │ │продовольст-│ │ │ │ │ │ │венного │ │ │ │ │ │ │сырья и │ │ │ │ │ │ │пищевых │ │ │ │ │ │ │продуктов │ │ │ │ │ │ │СанПиН │ │ │ │ │ │ │2.3.2.560-96│ │ └──────────┴─────────┴─────────┴───────────────────────┴────────────┴──────────────┘
9. Перечень дополнительной руководящей нормативной документации, необходимой для производства продукта
1. ГОСТ 13918-88 "Советское шампанское. Технические условия".
2. ГОСТы по контролю качества сырья и готовой продукции.
3. Инструкция по микробиологическому контролю шампанских и игристых вин.
4. ТИ 10-84-94. Технологическая инструкция по обработке виноградных виноматериалов с целью обеспечения их розливостойкости и методы испытаний виноматериалов на склонность к помутнениям физико-химического характера, утверждена Минсельхозпродом РФ 23.11.1994.
ИНСТРУКЦИЯ
ПО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ КОНТРОЛЮ ШАМПАНСКИХ И ИГРИСТЫХ ВИН
Настоящая инструкция предназначена для микробиологического контроля виноматериалов, купажей, чистой культуры дрожжей, ликеров, полуфабрикатов, готовой продукции, вспомогательных материалов, а также для контроля за соблюдением технологических и санитарно-гигиенических режимов в производстве шампанского и игристых вин.
Систематическое проведение микробиологического контроля позволяет следить за нормальным развитием чистых культур дрожжей и своевременно обнаруживать присутствие посторонней микрофлоры.
Инструкция является руководящим документом для работников заводских лабораторий при микробиологическом контроле производства шампанского и игристых вин.
Выполнение микробиологического контроля поручается лаборатории завода, которая несет ответственность за результаты анализов и внесение их в журналы ТХМК (Приложение 2).
1. Схема и общие правила контроля технологического процесса
1.1. Контроль поступающих виноматериалов
1.1.1. Пробы из поступающих виноматериалов отбирают по ГОСТ 14137-74 "Вино, виноматериалы, коньяки и коньячные спирты. Правила приемки и методы отбора проб", подвергают органолептической оценке и микроскопируют.
Виноматериал, содержащий в поле зрения не более 2 клеток бактерий при отсутствии спор плесневых грибов и клеток диких дрожжей, оценивается на "хорошо"; не более 3 клеток диких дрожжей или 5 клеток бактерий при отсутствии спор плесневых грибов - "удовлетворительно"; свыше 3 клеток диких дрожжей или 5 клеток бактерий - "неудовлетворительно". Виноматериал с оценкой "удовлетворительно" следует подвергать фильтрации и сульфитации; с оценкой "неудовлетворительно" - фильтрации, пастеризации при температуре 80 °С, фильтрации и сульфитации.
1.1.2. Для установления микробиологической чистоты виноматериалов и определения видового состава обнаруженных микроорганизмов в случае необходимости проводят посев на твердые и жидкие среды (Приложения 2, 4).
1.1.3. Вино, в котором проходит биологическое кислотопонижение, подвергают микробиологическому и химическому контролю не реже 1 раза в 10 дней. О начале яблочно-молочного брожения свидетельствуют резкое увеличение количества бактерий, снижение массовой концентрации титруемых кислот, повышение массовой концентрации летучих кислот. Завершается этот процесс в течение 15 - 20 сут. О его окончании судят по уменьшению пятен яблочной кислоты на хроматограмме. После окончания яблочно-молочного брожения вино фильтруют, сульфитируют из расчета массовой концентрации общей сернистой кислоты в вине от 100 до 120 мг/куб. дм и подвергают оклейке.
1.2. Контроль обработки и выдержки виноматериалов и купажей
1.2.1. Технологический процесс обработки ассамбляжей и купажей подвергают микробиологическому контролю.
В препаратах обработанного ассамбляжа и купажа после центрифугирования допускается не более 2 клеток мертвых микроорганизмов; при наличии большего числа микроорганизмов необходима повторная фильтрация или перезарядка фильтра.
1.2.2. Ассамбляжи и купажи, находящиеся на выдержке, микроскопируют после центрифугирования не реже 1 раза в месяц. При содержании в поле зрения не более 2 клеток мертвых микроорганизмов они оцениваются на "хорошо", не более 5 - "удовлетворительно". При развитии в ассамбляжах и купажах микроорганизмов они считаются неудовлетворительными и не подлежат дальнейшему хранению. Вино подвергают сульфитации, оклейке и фильтрации.
1.2.3. Для доливки резервуаров используют микробиологически чистое вино не моложе доливаемого.
1.2.4. Готовый купаж микроскопируют и испытывают на микробную стойкость. Купаж не должен содержать жизнеспособных микроорганизмов.
1.3. Контроль обескислороживания купажей
1.3.1. Купаж с дрожжевой разводкой, подаваемый на обескислороживание, контролируют не реже 1 раза в неделю. Смесь должна содержать 2 - 3 млн. клеток/куб. см дрожжей в хорошем физиологическом состоянии, доля мертвых дрожжей не должна быть более 5%, инфицированность бактериями и дикими дрожжами не допускается.
1.3.2. Обескислороженный купаж микроскопируют после центрифугирования 1 раз в неделю. Купаж, содержащий в поле зрения не более 3 клеток мертвых дрожжей или единичные молочнокислые бактерии, оценивается на "хорошо"; не более 6 мертвых клеток дрожжей или не более 5 клеток бактерий - "удовлетворительно"; единичные клетки диких дрожжей или более 5 клеток молочнокислых бактерий - "неудовлетворительно".
При хорошей и удовлетворительной оценке обескислороженный купаж контролируют 1 раз в неделю, а при неудовлетворительной оценке проводят санитарную обработку и перезарядку ферментера.
1.4. Контроль приготовления чистой культуры дрожжей
1.4.1. На всех стадиях приготовления разводки чистой культуры дрожжей обязательны строгое соблюдение правил санитарии и микробиологический контроль.
1.4.2. Раса дрожжей, применяемая в производстве, должна проверяться Отраслевой лабораторией технологии игристых вин Всероссийского научно-исследовательского института пивоваренной, безалкогольной и винодельческой промышленности 1 раз в год.
1.4.3. Для приготовления производственной разводки дрожжей используют последнюю генерацию дрожжей, в которой доля физиологически активных клеток составляет 95%, приготовленную в заводской лаборатории. Начальная концентрация дрожжей при загрузке дрожжерастильных аппаратов должна составлять не менее 10 млн. клеток/куб. см.
1.4.4. Питательную среду подвергают пастеризации и фильтрации. Питательная среда для приготовления разводки чистой культуры дрожжей не должна содержать микроорганизмы.
1.4.5. Дрожжевую разводку из всех дрожжерастильных аппаратов контролируют ежедневно, определяя количество клеток дрожжей и их физиологическое состояние (долю почкующихся и мертвых клеток, %).
1.4.6. Каждую дрожжевую разводку, отпускаемую производству, контролируют. Дрожжевая разводка с концентрацией не ниже 60 млн. клеток/куб. см, в которой доля мертвых клеток составляет не более 5%, оценивается на "хорошо"; с концентрацией дрожжей не менее 30 млн. клеток/куб. см с долей мертвых клеток не более 8% - "удовлетворительно"; с концентрацией дрожжей ниже 30 млн. клеток/куб. см с долей мертвых клеток больше 10% - "неудовлетворительно". Наличие в дрожжевой разводке посторонней микрофлоры не допускается, дрожжерастильный аппарат перезаряжают, предварительно подвергнув его санитарной обработке.
1.4.7. Воздух, поступающий от воздуходувки через обеспложивающий фильтр, контролируют 2 раза в месяц методом посева на твердую питательную среду. При росте более 5 колоний микроорганизмов обеспложивающий фильтр перезаряжают.
1.5. Контроль процесса шампанизации
Бутылочный способ
1.5.1. Содержание клеток дрожжей, физиологическое состояние и равномерность их распределения в тиражной смеси определяют непосредственно перед розливом. Концентрация дрожжей в тиражной смеси должна составлять 1 млн. клеток/куб. см с долей жизнеспособных клеток 95%; наличие посторонних микроорганизмов не допускается.
1.5.2. Процесс вторичного брожения каждой однородной партии тиража (по бутам) контролируют не менее 3 раз до окончания брожения, т.е. 1 раз в 10 сут. Содержание и физиологическое состояние дрожжевых клеток учитывают прямым микроскопированием шампанизируемого вина из бутылки.
1.5.3. При перекладках кюве в процессе послетиражной выдержки микробиологический контроль предусматривает наблюдение за изменением структуры осадка, его однородности в верхних и нижних бутылках уложенного штабеля, за физиологическим состоянием дрожжей и наличием посторонней микрофлоры в осадках.
1.5.4. При отклонении от нормального течения ремюажа микробиолог проверяет качество осадков и устанавливает причины.
1.5.5. Качество фильтрации экспедиционного ликера проверяют перед дозированием в бутылки.
1.5.6. Шампанское, используемое для дозировки, подвергают микробиологическому контролю.
1.5.7. Готовую продукцию подвергают микробиологическому контролю путем прямого микроскопирования центрифугированной пробы и посева вина на агаризованную питательную среду, а также испытанию на микробную стойкость вина (Приложение 4). В отдельных бутылках с шампанским (не более 2 из 10 бутылок) допускается наличие не более 2 мертвых клеток микроорганизмов и белковых частиц.
Непрерывный способ
1.5.8. Купаж после термообработки, направляемый на приготовление бродильной смеси, контролируют не реже 1 раза в месяц. При наличии диких дрожжей и бактерий в препарате купажа (после центрифугирования) необходимо провести санитарную обработку и перезарядку оборудования.
1.5.9. Качество фильтрации смеси купажа с ликером проверяют 1 раз в неделю.
1.5.10. Смесь купажа с ликером из передаточного резервуара контролируют 2 раза в месяц. При обнаружении микроорганизмов проводят санитарную обработку и перезарядку оборудования.
1.5.11. Бродильную смесь перед входом в аппараты для шампанизации контролируют не реже 1 раза в неделю. Она не должна содержать посторонних микроорганизмов, концентрация дрожжей должна составлять от 3 до 5 млн. клеток/куб. см с долей жизнеспособных клеток 95%.
1.5.12. Процесс шампанизации вина контролируют не реже 1 раза в 20 сут. В шампанизируемом вине определяют количество дрожжевых клеток, долю почкующихся и мертвых клеток; не допускается присутствие жизнеспособной инфицирующей микрофлоры.
1.5.13. Шампанизированное вино на выходе из установок микроскопируют 1 раз в неделю. Оно не должно содержать живых клеток дрожжей и посторонней микрофлоры.
1.5.14. Охлажденное шампанизированное вино из аппарата для обработки холодом контролируют 2 раза в год. При наличии в препарате посторонних микроорганизмов аппарат следует перезарядить.
1.5.15. Шампанское в приемных аппаратах перед розливом контролируют, в нем не должно быть микроорганизмов.
Резервуарный периодический способ
1.5.16. Бродильную смесь из акратофора после перемешивания подвергают контролю. Концентрация дрожжей должна быть от 2 до 4 млн. клеток/куб. см с долей жизнеспособных 95%. Бродильная смесь не должна содержать посторонних микроорганизмов.
1.5.17. Допускается загрузка на дрожжи, оставляемые в акратофоре от предыдущей загрузки, в случае положительного заключения микробиолога об их качестве и чистоте.
1.5.18. Процесс вторичного брожения контролируют не менее 2 раз до окончания брожения. В шампанизируемом вине определяют концентрацию дрожжевых клеток, долю почкующихся и мертвых клеток; не допускается присутствие посторонней микрофлоры.
1.6. Контроль розлива шампанского в бутылки и экспедиции
1.6.1. Качество мойки бутылок, приготовленных под налив, контролируют путем наружного осмотра и микроскопирования смывов ежедневно.
1.6.2. Пробки отбирают для микробиологического контроля ежедневно. Смывы с пробок не должны иметь постороннего запаха, механических частиц и микроорганизмов.
1.6.3. Проверяют качество фильтрации каждой партии шампанского.
1.6.4. Перед поступлением готовой продукции на внешнее оформление ее подвергают микробиологическому контролю путем прямого микроскопирования центрифугированной пробы, а также испытанию на микробную стойкость.
1.7. Контроль вспомогательных материалов
Объектами микробиологического контроля являются вода, оклеивающие вещества, танин, сахароза, лимонная кислота, двуокись углерода газообразная и др., так как они могут быть источниками инфекции.
1.7.1. Поступающую на завод воду микробиолог отбирает 1 раз в месяц. Анализ воды проводит санитарно-эпидемиологическая служба.
1.7.2. Каждую партию оклеивающих веществ, танина и лимонной кислоты проверяют при поступлении в производство. Они не должны содержать микроорганизмов, способных развиваться в вине, и механических включений.
1.7.3. Каждую партию сахарозы проверяют на присутствие спор плесневых грибов, слизеобразующих бактерий (Leuconostoc), микроорганизмов, способных развиваться в вине, а также механических включений (Приложение 8).
1.7.4. Контроль чистоты воздуха производственных помещений и углекислого газа проводят 1 раз в месяц.
1.8. Контроль санитарного состояния помещений, технологического оборудования и резервуаров
1.8.1. Производственные помещения контролируют один раз в неделю по внешним признакам путем осмотра поверхности резервуаров, стен, потолков, полов. При входе в производственные цеха на полу должны быть влажные коврики. Для предупреждения появления плесени ежегодно проводят побелку стен и потолка помещений раствором извести с добавлением медного купороса до массовой доли 10%.
1.8.2. Для предотвращения появления уксусной мушки (дрозофилы) в производственных помещениях при доливках, фильтрации, розливе и пр. следует тщательно обрабатывать наружные поверхности оборудования, фильтры, полы слабым раствором сернистого ангидрида.
1.8.3. Контроль обработки оборудования включает:
- внешний осмотр с целью выявления механических загрязнений, осадков, посторонних запахов;
- сравнение прозрачности и окраски последней смывной воды с водопроводной;
- микроскопирование смывов или мазка с поверхности оборудования.
При обнаружении жизнедеятельных микроорганизмов мойку и обработку оборудования следует повторить.
1.8.4. Резервуары после освобождения необходимо немедленно мыть, обрабатывать дезинфицирующими растворами, остатки воды удалять и контролировать качество обработки. Если резервуар был проверен, но не залит в течение нескольких дней, то контроль перед загрузкой повторяют.
1.8.5. Фильтры проверяют после обработки и мойки путем внешнего осмотра разобранного фильтра и микроскопирования смывов и мазков.
1.8.6. Насосы, шланги и коммуникации контролируют после обработки и промывки не реже 1 раза в неделю путем осмотра и микроскопирования последней смывной воды. После окончания работы насосов, шлангов и коммуникаций их необходимо мыть и контролировать качество обработки перед использованием.
1.8.7. Разливочные автоматы проверяют перед началом работы разливочной линии путем внешнего осмотра и микроскопирования смывных вод и мазков с нескольких участков.
2. Описание методов контроля
2.1. Отбор и подготовка проб к анализу
Все пробы, предназначенные для микробиологического исследования, следует отбирать при строгом соблюдении стерильности, чтобы исключить возможность загрязнения извне.
Перед отбором пробы следует тщательно продезинфицировать руки спиртом.
Пробы отбирают стерильной пипеткой или стеклянной трубкой с оттянутым концом. При необходимости отбора проб из различных слоев вина или при отборе сверху из неполного резервуара пользуются резиновым шлангом, в который вставлена стеклянная трубка с оттянутым концом. Пробоотборник стерилизуют спиртом перед употреблением, предварительно промыв его водой.
Часто при микробиологическом контроле шампанского производства пробу отбирают через краны, имеющиеся в резервуарах и коммуникациях. В этом случае тщательно промывают кран, а поверхность закрытого крана обрабатывают спиртом или обжигают пламенем спиртовки (факела). Перед отбором пробы сливают от 2 до 10 куб. дм вина, в зависимости от наличия застойных зон в месте отбора пробы.
Отбор проб производится в стерильную посуду. Непосредственно перед взятием образца колбу освобождают от ватной пробки, обжигают горловину, наполняют жидкостью и, перед тем как закрыть, снова обжигают горловину и пробку. Жидкость в колбу наливают не более чем на 1/3 объема, с тем чтобы при случайной встряске не смачивалась ватная пробка. Кроме того непосредственно перед центрифугированием, микроскопированием или посевом жидкость необходимо тщательно перемешать, если только проба не отбиралась для анализа пленки или осадка.
Микробиологический анализ необходимо проводить непосредственно после взятия проб, но не позднее чем через 2 ч при условии хранения образцов при температуре 2 °С +/- 1 °С. При контроле количественного состава микроорганизмов анализ проводят не позднее чем через 20 мин. после взятия пробы.
Микробиологическое исследование проводят путем микроскопирования, а если необходим более углубленный микробиологический анализ, то проводят посевы на жидкие или твердые питательные среды (Приложение 4).
2.2. Техника микроскопирования
При микробиологическом исследовании основным прибором служит микроскоп. При длительной многочасовой работе удобны биологические микроскопы с бинокулярной насадкой и наклонным тубусом. С помощью микроскопов изучают морфологию и строение клеток микроорганизмов. В микробиологической практике обычно используют оптические светлопольные микроскопы, часто с фазово-контрастным устройством, и люминесцентную микроскопию.
Наиболее распространены и удобны для работы в заводских микробиологических лабораториях биологические микроскопы МБИ-3, МБИ-6, МББ-1, МЛ-2, БИОЛАМы отечественного производства с наибольшим увеличением в 1350 раз, определяемым произведением степени увеличения объектива на увеличение окуляра.
В микробиологической практике применяют много дополнительных приборов, облегчающих исследование: осветительную лампу ОИ-7, устройство для наблюдения методом фазовых контрастов КФ-4, устройство люминесцентное ОИ-17, окулярный и объективный микрометры, счетные камеры Горяева, Тома-Цейса и др.
Микроскоп должен быть установлен стационарно на устойчивом столе или кронштейнах. Нельзя держать микроскоп на освещенном солнцем и теплом месте, так как при этом нарушается соединение отдельных линз в оптической системе. Микроскоп хранят под колпаком или чехлом.
При естественном освещении пользуются плоской стороной зеркала, а при искусственном - вогнутой.
Для микроскопирования пользуются окулярами 7х, 10х, 15х, объективами 10х, 20х, 40х, 90х (иммерсионный).
Хорошие результаты при работе с микроскопом могут быть получены только при условии правильного освещения объекта. Лучший способ освещения основан на системе Келера, которым необходимо пользоваться независимо от того, вмонтирован ли источник света в основание микроскопа или применяется специальный осветитель. Установку света выполняют в такой последовательности:
- ставят микроскоп и осветитель на крестовину, что обеспечивает необходимое расстояние - 120 мм - между источником света и зеркалом микроскопа;
- на предметный столик помещают препарат;
- устанавливают объектив 10х;
- поднимают конденсор до упора и открывают полностью его диафрагму;
- ставят вогнутое зеркало и закрывают диафрагму осветителя, оставив небольшое отверстие;
- включают осветитель и придают его корпусу такое положение, при котором свет падал бы в центр поля зрения;
- кладут на зеркало микроскопа кружок белой бумаги и получают контрастное изображение витка нити осветителя, передвигая патрон лампы;
- уменьшив реостатом яркость лампы осветителя, глядя в окуляр, поворачивают зеркало, находят в поле зрения изображение краев диафрагмы осветителя, которое имеет вид светлого пятна с нечеткими краями, и переводят в центр осторожным поворотом зеркала;
- используя объектив 10х, фокусируют объектив в области светлого пятна, слегка опуская конденсор, получают в плоскости препарата четко очерченное изображение краев диафрагмы осветителя, а с помощью зеркала переводят его в центр поля зрения;
- открывают диафрагму осветителя не более чем на 2/3;
- устанавливают объектив 40х или 90х и фокусируют на объект.
Яркость освещения регулируют изменением накала лампы осветителя с помощью реостата. Положение зеркала, конденсора и диафрагмы осветителя после установки менять нельзя.
2.3. Светлопольная микроскопия
Светлопольные микроскопы позволяют исследовать объекты в проходящем свете. После установки света по Келеру на столик микроскопа ставят предметное стекло, зажимают его клеммами и при помощи макровинта опускают тубус до тех пор, пока объектив не коснется стекла. Затем постепенно поднимают тубус до появления изображения. Дальнейшую фокусировку производят микрометрическим винтом. При работе с иммерсионным объективом на препарат наносят каплю иммерсионного масла и объектив 90х опускают в масло до соприкосновения со стеклом. Медленно поднимают тубус, находят изображение.
Методом светлопольной микроскопии пользуются при подсчете клеток микроорганизмов в анализируемых образцах при помощи счетных камер, используя окуляр 7х или 10х, объектив 40х.
Светлопольную микроскопию можно использовать для изучения морфологии клеток микроорганизмов, предварительно окрашенных специальными красителями (реактив Люголя, судан III, метиленовая синь по Леффлеру и др.), а также для проверки чистоты анализируемой пробы (Приложение 5).
2.4. Микроскопия с фазово-контрастным устройством
Фазовый контраст является одним из совершенных и доступных методов повышения контрастности неокрашенных живых препаратов, позволяющих получать контрастное изображение, в котором темные и светлые места соответствуют различной толщине оптической плотности препарата.
Принцип фазовой микроскопии состоит в том, что с помощью специального конденсора с кольцевой диафрагмой различной величины, соответствующей различным объективам, производится изменение фазы проходящих через препарат световых лучей на четверть длины волны, в результате чего получается изображение объекта, в котором степень затемнения деталей прямо пропорциональна их толщине.
Для фазово-контрастной микроскопии нужно иметь: микроскоп любой марки, осветитель и фазово-контрастное устройство КФ-4.
При микроскопировании с фазовым контрастом в дрожжевых организмах обнаруживают резко очерченную оболочку, темную цитоплазму, светлые вакуоли, четко выраженные включения как в цитоплазме, так и в вакуолях. Иногда можно наблюдать ядра и хондриосомы. Кроме того, можно обнаружить изменения в клеточном протопласте, особенно его вакуолизацию, сжатие и отхождение от оболочки, появление зернистости, жировое перерождение.
Преимущество метода фазово-контрастной микроскопии заключается в том, что контраст создается только оптическим путем, без дополнительного окрашивания препаратов.
2.5. Люминесцентная микроскопия
Принцип люминесцентной микроскопии основан на способности микроорганизмов светиться под влиянием падающего на них света. Люминесценцию можно наблюдать с помощью обычного микроскопа, установив на пути яркого источника света к препарату синий светофильтр, пропускающий сине-фиолетовые лучи, вызывающие люминесценцию частей препарата, способных светиться. Синий свет, возбуждающий эту люминесценцию, значительно ярче люминесценции, поэтому он засвечивает поле зрения. Его убирают желтым светофильтром, который помещают на окуляр микроскопа, и наблюдатель видит на черном фоне люминесцирующие объекты. Для микробиологических исследований наиболее удобен люминесцентный микроскоп МЛ-2, выпускаемый отечественной промышленностью.
Однако большое значение приобретают приемы получения вторичной люминесценции. Любой микроскопический препарат можно превратить в ярко люминесцирующий, обработав его специальными красителями-флуорохромами, обладающими люминесценцией (Приложение 5).
Изучаемые структуры или исследуемые вещества ярко светятся различным светом на темном фоне.
Люминесцентная микроскопия широко применяется для выявления живых и мертвых клеток микроорганизмов и для изучения структуры дрожжевых клеток, динамики перестроек и изменений в протопласте в связи с функциональной активностью и условиями существования дрожжей.
Флуорохром должен свободно проникать внутрь объекта, связываться с его определенными структурами, придавая им характерное свечение, разнообразное по цвету и яркости.
Наиболее пригодными для прижизненной обработки микроорганизмов являются следующие флуорохромы:
- примулин, с помощью которого различают живые и мертвые клетки (последние ярко светятся). У живых клеток светится только оболочка, а внутреннее содержимое сливается с темным фоном;
- акридиновый оранжевый, относительно слабо связываясь с белками протоплазмы, придает им темно-зеленое свечение. Он накапливается в значительном количестве в ядре, где, соединяясь с ядерными нуклепротеидами, люминесцирует ярким светло-зеленым светом, соединяясь с рибонуклеиновой кислотой, образует гранулы, светящиеся огненно-красным светом. Вакуоли различимы как темные пятна;
- аурофосфин аккумулируется митохондриями, ярко светящимися золотистым светом на темном фоне.
2.6. Приготовление препаратов микроорганизмов
Микроорганизмы можно микроскопировать в живом или фиксированном (убитом) состоянии. Для препаратов применяют предметные стекла размером 76 х 26 мм, толщиной (1,2 +/- 0,2) мм, покровные стекла размером 18 х 18 мм или 24 х 24 мм и толщиной (0,16 +/- 0,01) мм. Новые предметные и покровные стекла ополаскивают теплой водой, кипятят 10 мин. в растворе соляной кислоты 0,25 - 0,50 моль/куб. дм, промывают водопроводной, а затем дистиллированной водой, потом кипятят 10 мин. в мыльной (хозяйственное мыло) дистиллированной воде и тщательно промывают дистиллированной водой. Стекла, бывшие в употреблении, ополаскивают теплой водой, кипятят 10 мин. в мыльной дистиллированной воде и тщательно промывают водопроводной, а затем дистиллированной водой. Предметные стекла сушат в сушильном шкафу и хранят в сосуде с плотной крышкой. Покровные стекла хранят в бюксах с этиловым спиртом с объемной долей 95%.
Клетки микроорганизмов для посева или приготовления препаратов берут бактериологической петлей, если микроорганизмы выращены на плотной среде; для взятия клеток из жидкой среды чаще используют стерильные пипетки.
Бактериологические петли делают, используя проволоку из платины или нихрома диаметром 0,2 - 0,4 мм, которую закрепляют в металлическом держателе или впаивают в стеклянную палочку. Конец проволоки загибают в виде плотно замкнутой петли.
Посевы микроорганизмов в стерильные среды осуществляют в изолированных помещениях, лучше в боксах (Приложение 3).
2.6.1. Приготовление препаратов живых клеток.
Препарат "раздавленная капля" используют для установления формы клеток микроорганизмов, их размеров, структуры, подвижности, характера размножения и способа спорообразования.
На обезжиренное предметное стекло наносят каплю исследуемого материала. Если микроскопируют культуру, выросшую на плотной питательной среде, на предметное стекло предварительно наносят каплю стерильной водопроводной воды, затем петлей переносят в нее небольшое количество исследуемой культуры, размешивают и плотно покрывают покровным стеклом. Капля с исследуемым материалом должна быть такой, чтобы после прижимания ее покровным стеклом жидкость не выступала из-под стекла. Избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой.
Для учета мертвых дрожжевых клеток, определения гликогена и других запасных веществ в дрожжах, а также для лучшего рассмотрения и определения бактериальной инфекции готовят препараты с прижизненной окраской (окрашенные микроорганизмы остаются живыми долгое время). Приготовление этого препарата аналогично приготовлению препарата "раздавленная капля", только вместо водопроводной воды на предметное стекло наносят каплю краски (метиленовый синий, раствор Люголя, нейтральный красный и др.) (Приложение 5).
Препарат "висячая капля" используют для наблюдения за подвижностью микроорганизмов, их размножением, образованием и прорастанием спор, отношением клеток к химическим раздражителям. Препарат готовят на специальном предметном стекле с углублением. Ободок лунки или края покровного стекла смазывают вазелином. На середину покровного стекла наносят маленькую каплю исследуемой суспензии, которое поворачивают каплей вниз и накрывают лунку. Капля должна свободно висеть, не касаясь краев дна лунки. Капля оказывается герметизированной во влажной камере, что допускает многодневное наблюдение за объектом.
2.6.2. Приготовление препаратов фиксированных клеток.
Фиксирование окрашенных препаратов используют для выявления морфологических особенностей микроорганизмов и для проверки чистоты культуры. Эти препараты могут храниться длительное время. Приготовление препарата включает следующие этапы: приготовление мазка, высушивание, фиксацию и окраску. На обезжиренное предметное стекло наносят исследуемый материал и краем покровного стекла равномерно распределяют его тонким слоем. Препарат сушат при комнатной температуре на воздухе или слегка нагревают над пламенем горелки, после чего фиксируют для того, чтобы обеспечить хорошее окрашивание, прилипание клеток к стеклу и предотвратить смывание препарата. Фиксируют микроорганизмы термической обработкой, для чего нижней стороной стекла 3 - 4 раза проводят над пламенем спиртовки. Фиксацию химическими веществами применяют при изучении строения бактериальной клетки, для чего препарат погружают на несколько минут в спирт, эфир или другие яды, которые смывают водой. После фиксации клетки микроорганизмов окрашивают анилиновыми красителями - метиленовым синим, основным фуксином, генциановым фиолетовым (Приложение 5). Фиксированный мазок покрывают фильтровальной бумагой и наливают на нее раствор красителя. Препарат выдерживают 1 - 3 мин., после чего снимают фильтровальную бумагу, промывают струей проточной воды и высушивают на воздухе.
Фиксированные препараты рассматривают при помощи иммерсионного объектива 90х без покровного стекла.
2.7. Методы определения количества клеток микроорганизмов
Количественный учет микроорганизмов необходим при микробиологическом контроле производственных процессов, санитарно-гигиеническом контроле и в научных исследованиях.
Микробиолог проводит общий подсчет дрожжевых клеток, дифференцированный подсчет мертвых и почкующихся клеток, а также инфицирующей микрофлоры при контроле поступающих виноматериалов, дрожжевой разводки из дрожжерастильных аппаратов, купажа до обескислороживания и после обескислороживания, бродильной смеси перед поступлением в бродильные аппараты шампанизируемого вина из пробоотборника, установок для шампанизации вина, готовой продукции для оценки правильности протекания технологических процессов, степени инфицирования на различных стадиях и необходимости исправления.
Учитывая количество микроорганизмов после мойки бутылок, коммуникаций, производственной тары и др., микробиолог дает заключение о чистоте мойки и необходимости повторной обработки.
Для определения общего количества микроорганизмов и учета представителей отдельных групп и видов микроорганизмов применяют ряд методов подсчета клеток:
- прямой подсчет клеток под микроскопом в одном поле зрения, в счетных камерах, на фиксированных окрашенных мазках, на мембранных фильтрах и др.;
- учет роста на питательных средах.
Прямой подсчет можно производить в поле зрения микроскопа и в счетной камере в единице объема.
Исследуемую жидкость тщательно взбалтывают не менее 1 мин., готовят препарат "раздавленная капля" и подсчитывают в 10 полях зрения общее число клеток по интересующему виду микроорганизмов или стадиям развития. Полученные среднеарифметические или выраженные в процентном отношении цифры количества микроорганизмов дают представление о составе микрофлоры в одном поле зрения.
Для определения количества клеток микроорганизмов в единице объема пользуются счетными камерами с сетками системы Горяева, Бюркера, Тома и др., одинаковыми по принципу их построения.
Счетная камера представляет собой толстое предметное стекло, разделенное бороздками на части. Центральная часть стекла ниже боковых на 0,1 мм, на ней нанесена сетка. В основе всех сеток лежит малый квадрат площадью 0,0025 кв. мм. Площадь большого квадрата сеток всегда соответствует площади 16 малых и равна 0,04 кв. мм. Сетка Горяева имеет 225 больших квадратов (15 х 15), занимающих площадь 9 кв. мм; эти цифры указаны на предметном стекле.
Обычно ведут подсчет в камерах с окуляром 7х или 10х и объективом 40х и 5 больших квадратах, расположенных по диагонали, т.е. по углам и в центре. Каплю исследуемой суспензии после тщательного взбалтывания, не менее 1 мин., сухой стеклянной палочкой или петлей наносят на сетку и покрывают шлифованным специальным покровным стеклом (18 х 18) толщиной 0,30 +/- 0,05 мм. Можно пользоваться обычными покровными стеклами (24 х 24) толщиной 1,16 +/- 0,01 мм, при необходимости делают разведение суспензии, так как в одном большом квадрате число клеток микроорганизмов не должно превышать 60 - 80, а в пяти квадратах - 400. Жидкость должна равномерно распределяться по поверхности сетки, без пузырьков. Покровное стекло прижимают большими пальцами к боковым площадкам камеры и притирают до появления радужных (ньютоновых) колец. При подсчете клеток культур дрожжей, образующих конгломераты, необходимо к исследуемой суспензии добавить равное количество серной кислоты с массовой концентрацией 10% и встряхивать не менее 5 мин. для разъединения скоплений клеток. При подсчете следует учитывать разбавление вдвое, сделанное раствором серной кислоты. Подсчет клеток начинают через 3 - 5 мин. после заполнения камеры, для того чтобы клетки осели и были видны под микроскопом в одной плоскости. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также пересекающие верхнюю и правую стороны квадрата.
Концентрацию клеток вычисляют по формуле:
М = 50000 х а х n,
где:
М - число микроорганизмов в суспензии, млн. клеток/куб. см;
50000 - коэффициент пересчета объема пяти больших квадратов на 1 куб. см;
а - общее количество подсчитанных клеток микроорганизмов в пяти больших квадратах;
n - кратность разведения.
Прямой подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках дает возможность сохранять препараты длительный срок. На обезжиренное предметное стекло помещают определенный объем суспензии клеток, не более 0,05 куб. см, и равномерно распределяют на площади, равной 6 кв. см. Для этого удобно под предметное стекло подложить миллиметровую бумагу, на которой отмечен прямоугольник нужного размера. Препарат подсушивают на воздухе и фиксируют 10 - 20 мин. спиртом с объемной долей 96%. Затем препарат красят 1 - 2 мин. фуксином Циля, тщательно промывают водой и высушивают на воздухе. Подсчет клеток микроорганизмов проводят с иммерсионным объективом в квадратах окулярной сетки, которую вставляют в окуляр. Просчитывают не менее 10 полей зрения, передвигая препарат по диагонали. При отсутствии окулярной сетки можно подсчитывать клетки микроорганизмов на всей площади поля зрения микроскопа. Общее количество подсчитанных клеток должно быть не менее 600.
Площадь поля зрения определяют с помощью микрометра, который помещают
на столик микроскопа вместо препарата, и при том же увеличении, при котором
проводили подсчет клеток, измеряют сторону квадрата сетки (или диаметр поля
2
зрения) и по формуле S = пи r вычисляют его площадь. Количество клеток,
содержащихся в 1 куб. см суспензии, подсчитывают по формуле:
a х S х n
M = ----------,
0,05 х sгде:
M - число микроорганизмов в исследуемой суспензии, млн. клеток/куб. см;
a - количество клеток в одном поле зрения;
S - площадь мазка, кв. мкм;
0,05 - объем взятой суспензии, куб. см;
n - кратность разведения;
s - площадь квадрата сетки, кв. мкм.
Высев на плотные среды (метод Коха) основан на том, что из каждой жизнедеятельной клетки микроорганизмов при посеве на плотную среду в чашку Петри развивается отдельная колония. Вместе с тем результаты определения этим способом численности микроорганизмов, образующих цепочки или конгломераты клеток, будут всегда несколько занижены. Чашечный метод позволяет учесть не только численность микроорганизмов в субстрате, но и оценить их разнообразие по морфологии колоний. Этот способ применяется при контроле чистоты воздуха и качества мойки оборудования.
При небольшом содержании микроорганизмов, не более 200 в 0,1 куб. см, делают посев в чашки Петри без предварительного разведения.
При значительной обсемененности анализируемую пробу разводят стерильным физиологическим раствором. Стерильной пипеткой переносят 1 куб. см исследуемого образца в пробирку с 9 куб. см стерильного физиологического раствора и получают разведение 1:10. Чтобы получить второе разведение - 1:100, берут 1 куб. см стерильного раствора. Полученную суспензию тщательно перемешивают, вбирая в пипетку и выпуская из нее взвесь не менее 3 - 5 раз. Таким же образом готовят и последующие разведения. Для приготовления каждого разведения следует использовать отдельную пипетку. Степень разведения зависит от предполагаемой обсемененности исследуемого образца.
Посев в чашки может быть поверхностным и глубинным. При поверхностном посеве на застывшую агаризованную среду наносят обычно 0,05 - 0,2 куб. см суспензии и стерильным шпателем равномерно распределяют ее на поверхности. Затем этим же шпателем проводят по всей поверхности во второй чашке, куда посевной материал не вносили. Из каждого разведения делают 2 - 3 параллельных высева, пользуясь каждый раз отдельным шпателем. Чашки с засеянными средами помещают в термостат с температурой (26 +/- 2) °С, благоприятной для развития выявляемых микроорганизмов.
При глубинном посеве 0,1 куб. см исследуемой среды тщательно перемешивают с 15 куб. см расплавленной питательной среды в чашке Петри. Для получения достоверных результатов каждый посев делают на 2 - 3 чашки. Засеянные и застывшие чашки термостатируют, помещая в термостат крышками вниз. Через 3 - 5 сут. подсчитывают выросшие колонии, суммируя посев на двух чашках. Результаты параллельных высевов суммируют и определяют среднее число колоний, выросших на одной чашке. Количество клеток в 1 куб. см исследуемого образца вычисляют по формуле:
n
а х 10
М = -------,
vгде:
М - число микроорганизмов в суспензии, млн. клеток/куб. см;
10 - коэффициент разведения;
n - кратность разведения;
а - среднее число колоний на одной чашке;
v - объем высеваемой суспензии, куб. см.
Лучшим разведением считается то, при высеве из которого выросло от 50 до 150 колоний. Следует иметь ввиду, что достоверность результатов зависит не только от числа повторностей, но и от точности подсчета колоний. Чашечный метод количественного учета микроорганизмов наиболее широко распространен в микробиологической работе. Несмотря на кажущуюся простоту выполнения, он требует от микробиолога предельного внимания и аккуратности.
2.8. Определение микробной стойкости вин
Гарантированная стойкость вин к микробным видам помутнений обеспечивается лишь при отсутствии в вине живых клеток. Факторами, стимулирующими микробное помутнение, могут быть температура, кислород, повышение величины рН, наличие углеводов, азотистых веществ, витаминов, сернистой кислоты и др.
Микробную стойкость вина определяют по времени развития микроорганизмов в пробе вина.
Отбор пробы проводят стерильно от однородной партии вина или каждой емкости согласно ГОСТ 14137-74 "Вино, виноматериалы, коньяки и коньячные спирты. Правила приемки и методы отбора проб". От средней пробы отбирают 10 куб. см вина, после центрифугирования осадок микроскопируют. Обработанное и подготовленное к розливу вино не должно содержать в среднем более 2 клеток микроорганизмов в 10 полях зрения. При наличии большего количества микроорганизмов определяют его микробиологическое состояние по отношению к дрожжам и уксуснокислым бактериям, для чего исследуемую пробу вина в пробирке с ватной пробкой помещают в термостат с температурой (26 +/- 2) °С. Наблюдение за развитием дрожжей и уксуснокислых бактерий в вине ведут в течение 6 сут. Вино считается стойким, если только на четвертые сутки обнаружен рост винных или пленчатых дрожжей и если на пятые и шестые сутки не обнаружены уксуснокислые бактерии. Неудовлетворительным считается вино, если рост бактерий и пленчатых дрожжей появился на первые или вторые сутки, в остальных случаях - нестойким.
Кроме того, определяют микробиологическое состояние по отношению к молочнокислым бактериям. Среднее количество клеток определяют микроскопированием в 10 полях зрения осадка после центрифугирования 10 куб. см вина. Вино считается инфицированным, если количество молочнокислых бактерий составляет более 3 клеток в поле зрения, сильно инфицированным - более 6, неудовлетворительным - более 15, причем появляются посторонний тон и привкус при массовой концентрации летучих кислот более 1,2 г/куб. дм.
Микробиологическое состояние вина, инфицированного молочнокислыми бактериями, можно определить и путем посева пробы вина в количестве 0,5 куб. см в питательные среды со спиртом или в солодовое сусло с нистатином (Приложение 3).
Наблюдения за развитием молочнокислых бактерий начинают через 3 сут. после высева и ведут не менее 7 сут. при высеве в среду с нистатином и не менее 15 сут. при высеве в среду со спиртом. Вино считается стойким, если на среде с нистатином не обнаружено роста бактерий на седьмые сутки и на среде со спиртом - на пятнадцатые сутки. В случае помутнения среды на третьи сутки вино считается инфицированным, а вино с наличием летучих кислот с массовой концентрацией свыше 1,2 г/куб. дм и посторонним тоном - неудовлетворительным. Нестойкое вино сульфитируют из расчета массовой концентрации свободной сернистой кислоты в вине от 20 до 25 мг/куб. дм и ведут за ним постоянный микробиологический контроль. Неудовлетворительное вино оклеивают и фильтруют, после чего пастеризуют при температуре 80 °С в течение 15 мин. и сульфитируют из расчета массовой концентрации свободной сернистой кислоты в вине от 20 до 25 мг/куб. дм. Дальнейшее хранение обработанных вин не рекомендуется.
Инфицированное молочнокислыми бактериями вино с высокой титруемой кислотностью проверяют на наличие яблочной кислоты и при необходимости проводят яблочно-молочное брожение.
2.9. Методы контроля санитарно-гигиенического состояния производства
Бутылки. Отобранные для анализа 2 бутылки закрывают ватными пробками. Затем в каждую из них вносят по 50 куб. см стерильной водопроводной воды. После энергичного взбалтывания смывную воду переносят в простерилизованные центрифужные пробирки и центрифугируют 10 - 15 мин. при 3000 - 5000 об./мин. Затем жидкость сливают, а последнюю каплю микроскопируют.
Более точным методом определения чистоты бутылок является посев на твердую питательную среду. Для этого 1 куб. см смывной воды стерильно переносят в чашку Петри со средой и термостатируют при 25 °С в течение 3 - 6 сут. После выращивания посевов определяют общее количество микроорганизмов в 1 куб. см смывной воды и делают пересчет на одну бутылку, умножая количество подсчитанных колоний на объем смывной воды (50 куб. см).
Пробки. Для микробиологического анализа стерильным пинцетом отбирают три пробки в стерильную широкогорлую колбу и заливают стерильной водопроводной водой объемом 50 куб. см. Колбу закрывают ватной пробкой и сильно встряхивают в течение 5 мин. Смывную воду готовят для микроскопирования так же, как при контроле бутылок.
Сыпучие материалы (оклеивающие вещества, танин, сахароза и др.). Отбирают среднюю пробу с массой не менее 100 г от партии из разных мест упаковки с помощью стерильного шпателя или ложки, переносят в стерильную посуду и тщательно перемешивают. В колбу с 10 куб. см стерильной водопроводной воды вносят 1 г этого материала. После 5 мин. встряхивания пробу центрифугируют и микроскопируют.
Воздух. Бактериологическое исследование воздуха производственных помещений проводят методом оседания, основанным на седиментации микробных клеток на поверхности агара в открытой чашке Петри. Для этого в стерильные чашки Петри разливают агаризованную среду. После затвердевания среды завернутые в стерильную бумагу чашки Петри переносят в цех для исследования. В помещении чашку открывают и кладут на горизонтальную поверхность. В зависимости от предполагаемого бактериального загрязнения чашку выдерживают 5, 10, 15 мин., а затем ставят в термостат на 3 - 5 сут. при температуре 25 °С и подсчитывают выросшие колонии. В 1 куб. м воздуха должно содержаться не более 1000 клеток микроорганизмов.
Установлено, что в течение 5 мин. на чашку площадью 100 кв. см оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 куб. дм воздуха. Исходя из этого рассчитывают количество микроорганизмов в 1 куб. м воздуха по формуле:
A х 5 х 100
х = ----------- х 100,
S Kгде:
х - число микроорганизмов в воздухе, млн. клеток/куб. м;
100 - число для пересчета площади чашки, кв. см;
100 - число для пересчета 10 куб. дм воздуха в 1 куб. м;
A - количество колоний, выросших в чашке Петри;
S - площадь чашки, кв. см;
K - временной коэффициент (если чашка открыта 5 мин. - 1, 10 мин. - 2, 15 мин. - 3).
Этот метод не дает точных количественных показателей загрязненности воздуха, но при одинаковых условиях анализа можно получить сравнительные данные. Для контроля необходимо проводить анализ воздуха во дворе завода (в летнее время, после поливки двора). Количество микроорганизмов в воздухе производственных помещений не должно превышать количества микроорганизмов в наружном атмосферном воздухе.
При анализе воздуха, поступающего в дрожжевые аппараты, не всегда имеется возможность внести чашку Петри в воздуховод с обеспложенным воздухом. В этом случае используют колбу типа промывалки. На дно колбы наливают 10 - 12 куб. см агаризованной питательной среды и вместе с резиновой трубкой, закрытой ватной пробкой, стерилизуют в автоклаве. После застывания питательной среды колбу через резиновую трубку присоединяют к воздуховоду. Воздух пропускают через колбу в течение 2 ч, после чего колбу закрывают ватной пробкой и помещают в термостат на 3 - 5 сут. при 25 °С.
Качество очистки воздуха, подаваемого в дрожжевые аппараты, можно также проверить путем его барботирования (пропускания) в течение 2 ч через колбу со стерильной водопроводной водой и последующим посевом 1 куб. см на агаризованную питательную среду. Улавливание микробных клеток проводят, подсоединяя колбу к обводной линии воздуховода после фильтра. Таким же методом анализируют двуокись углерода газообразную, но время пропускания газа ограничивают 20 мин.
Оборудование (резервуары, фильтры, насосы, коммуникации, разливочные автоматы и др.). Непосредственно после промывки оборудования отбирают пробу последней смывной воды через спускной кран в стерильную пробирку, предварительно слив несколько литров воды. При невозможности отбора из крана смывную воду берут со дна резервуара стерильной пипеткой через люковое отверстие. 10 куб. см смывной воды центрифугируют в течение 10 - 15 мин. при 3000 - 5000 об./мин. и микроскопируют.
Мазки с поверхности оборудования берут стерильным ватным тампоном, смоченным в стерильной водопроводной воде. При помощи пинцета тампон увлажняют в колбе с 50 куб. см стерильной воды, протирают им поверхность площадью около 100 кв. см и переносят в ту же колбу. После тщательного взбалтывания воду центрифугируют и микроскопируют.
При проверке шлангов, не содержащих смывной воды, через них пропускают 1 - 2 куб. дм водопроводной воды. Эту воду собирают в стерильную колбу (первые порции используют для промывания краев шланга). 10 куб. см смывной воды центрифугируют и микроскопируют. Для получения более точных данных о качестве обработки и мойки оборудования можно производить посевы 1 куб. см смывных вод на твердую питательную среду.
2.10. Методы дезинфекции
В зависимости от применяемого агента различают физические и химические методы дезинфекции. К физическим методам относятся: нагревание (обработка паром, кипячение), обеспложивающая фильтрация, действие ультразвука, облучение и др. В промышленности используется в основном дезинфекция нагреванием. Большинство неспорообразующих микроорганизмов погибают при нагревании до температуры 60 - 70 °С в течение 10 - 20 мин. Некоторые бактерии и споры микроорганизмов более устойчивы к воздействию высокой температуры и не погибают при нагревании до температуры 80 - 90 °С.
Эффективным методом является пропаривание оборудования насыщенным паром. Имеет значение и способ подачи пара. При пропускании пара струей через коммуникации микроорганизмы уничтожаются уже через 5 - 10 мин.
Для частичного уничтожения микроорганизмов применяют горячую воду. Воздействие горячей воды на оборудование и инвентарь при температуре 80 - 85 °С в течение 20 - 30 мин. оказывается эффективным. Бактерицидное действие горячей воды усиливается при ее подщелачивании.
К химическим методам дезинфекции относится применение различных антисептиков. Перед их использованием необходимо провести механическую очистку аппаратуры. После дезинфекции все обработанное оборудование и коммуникации тщательно промывают водой до полного удаления агента. Необходимо использовать только свежеприготовленные дезинфицирующие растворы.
Дезинфицирующее средство выбирают в зависимости от степени инфицирования объекта, материала оборудования, степени изношенности, его размеров.
Практическое применение нашли следующие вещества: раствор перманганата калия с массовой концентрацией 2,5 г/куб. дм, сернистый ангидрид, раствор кальцинированной соды с массовой концентрацией до 20 г/куб. дм, раствор каустической соды с массовой концентрацией 1 г/куб. дм, раствор хлорной извести с массовой концентрацией 20 г/куб. дм и антиформин.
Эффективность действия хлорной извести определяется массовой долей в ней активного хлора. При хранении под действием тепла и света известь разлагается, содержание активного хлора и антимикробное действие ее снижаются.
Массовую долю активного хлора определяют следующим образом. 10 г средней пробы хлорной извести растирают в ступке с небольшим количеством воды, смесь переносят в колбу вместимостью 1 куб. дм и доливают водой до метки. После тщательного перемешивания отбирают 100 куб. см, прибавляют к смеси 1 - 2 г йодистого калия и 10 - 20 капель соляной кислоты (плотностью 1,19). Выделившийся йод титруют раствором гипосульфита с молярной концентрацией 0,1 моль/куб. дм в присутствии крахмала. 1 куб. см раствора гипосульфита с массовой концентрацией 1 г/куб. дм соответствует 0,0035 г хлора.
Массовую долю активного хлора вычисляют по формуле:
х = 0,0035 х n х 100,
где:
х - массовая доля активного хлора, %;
0,0035 - коэффициент пересчета объема израсходованного на титрование гипосульфита в массовую долю активного хлора;
100 - коэффициент для выражения массовой доли хлора, %;
n - объем раствора гипосульфита концентрацией 0,1 моль/куб. дм (0,1 н раствор), израсходованного на титрование, куб. см.
Активным дезинфектантом является антиформин. Его готовят из хлорной извести, кальцинированной и каустической соды. Готовят три отдельных раствора: 5 кг хлорной извести растворяют в 150 куб. дм воды; 10 кг кальцинированной соды растворяют в 20 куб. дм горячей воды при температуре 65 - 70 °С; 2,5 кг каустической соды растворяют в 12 куб. дм воды. Первый и второй растворы соединяют, хорошо перемешивают и выливают в раствор каустической соды. Затем антиформин оставляют на 7 сут. до полного осветления, раствор декантируют и разводят в 15 - 20 раз водой для получения рабочего раствора.
Контроль эффективности дезинфицирующих растворов проводят следующим образом. В пробирку заливают 10 куб. см исследуемого раствора и прибавляют 1 куб. см дрожжевой разводки. После тщательного взбалтывания ее оставляют на 2 ч, после чего делают посевы на жидкую и твердую питательные среды. Посевы выдерживают при температуре 25 °С в течение 3 - 6 сут. Раствор антисептика считается активным, если не обнаруживается рост микроорганизмов.
Приложение 1 (рекомендуемое)
СПИСОК ОБОРУДОВАНИЯ, ПОСУДЫ И РЕАКТИВОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ (ИЗ РАСЧЕТА МОЩНОСТИ ПРЕДПРИЯТИЯ 5 МЛН. БУТЫЛОК В ГОД)
┌───┬─────────────────────────────────────────────────┬──────────┐ │ N │ Наименование │Количество│ │п/п│ │ │ ├───┼─────────────────────────────────────────────────┼──────────┤ │ 1 │ 2 │ 3 │ ├───┼─────────────────────────────────────────────────┼──────────┤ │1. │Автоклав │1 │ │2. │Микроскоп биологический бинокулярный │1 │ │3. │Микроскоп люминесцентный │1 │ │4. │Сушильный шкаф │2 │ │5. │Термостат с терморегулятором │2 │ │6. │Холодильник по ГОСТ 16317-76 │1 │ │7. │Весы технохимические электрические │1 │ │8. │Весы аналитические │1 │ │9. │Центрифуга 6000 об./мин. по ГОСТ 3585-79 или │1 │